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研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显著提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显著,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显著上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显著减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显著低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显著增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显著降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显著增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显著下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显著提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。