准确地鉴定活性分子在体内的作用靶标在药物的研发过程中具有重要的意义,而活性导向的蛋白谱学分析（Activity-based protein profiling,ABPP）近年来被广泛应用于探究活性分子细胞水平的作用靶标。本课题组近期报导小分子DR在体外对激酶DDR1具有高度抑制活性,并且其系列代表候选分子在小鼠模型中表现出良好的抗炎活性,具有广阔的开发前景,但在细胞水平上的作用靶点仍然未知。因此本课题主要运用活性导向的蛋白谱学分析的技术思路,基于DR合成了具有良好生物活性的光亲和探针分子DR-2和DR-4。围绕这些小分子探针通过化学蛋白质组学及生物成像进行多方面的细胞靶点的识别及验证。此部分工作主要包括以下几部分:1.通过考察小分子DR与激酶DDR1的共晶结构,发现DR的尾部N-甲基哌嗪位于结合口袋的亲水区域,属于可修饰部位。因此以DR为母体化合物对其尾部进行修饰,合成了光亲和探针DR-2及DR-4。2.对合成的探针分子进行DDR1激酶抑制活性测试,以母体分子DR为参照,确证探针分子的生物活性。实验结果表明,探针分子DR-2和DR-4对DDR1激酶保持良好的抑制活性,IC₅₀分别为258.6 nM和576.6 nM。3.通过对探针分子进行浓度依赖,时间依赖及竞争性的蛋白标记实验,确定了探针分子在体内及体外的实验条件下均有较高的标记效率。随后通过开展亲和层析-蛋白免疫印迹（pull-down/western blot）实验,确定探针能在活细胞体内标记已知靶标蛋白DDR1,确证探针分子的有效性。并同时通过细胞成像实验发现探针分子的靶点主要分布于细胞质及细胞膜中。4.对亲和层析的样品进行生物质谱（LC-MS/MS）的验证,发现组织蛋白D（CTSD）为DR在细胞水平上的主要靶点,并通过蛋白免疫印迹及CETSA实验进行验证。随后我们进一步发现DR主要通过聚集于溶酶体中而增强了与CTSD的相互作用。此外,鉴于DDR1为潜在的治疗炎症等相关疾病的重要靶点,我们合成了带有生物正交反应基团反式环辛烯的探针分子DR-1及DR-3。通过激酶活性抑制测试及细胞成像实验我们希望探针分子DR-3能够在活细胞内标记目标蛋白DDR1,监测DDR1在亚细胞的定位及表达水平,为疾病诊断及治疗提供有价值的工具分子。