目的:基于叶绿体基因组全长序列,构建一种对药用黄精来源的多花黄精快速的分子鉴别方法,并对多花黄精多糖生合成中的关键酶基因(Pc UER1)进行研究分析,为多花黄精种质资源研究及黄精多糖和薯蓣皂苷合成的深入研究提供理论基础。方法:(1)实地采集多花黄精样品,采用改良CTAB法提取DNA,进行叶绿体全基因组测序、组装和分析;(2)基于多花黄精、黄精和滇黄精叶绿体基因组测序序列信息,通过Bio Edit软件中的clustal W进行序列比对,筛选出多花黄精特异性鉴别位点并设计双阻滞位点特异性引物,构建快速鉴别多花黄精技术;(3)提取多花黄精根、茎、叶、根茎等四种部位中的RNA,筛选最优RNA产物,进行RNA-Seq并分析和功能注释,推测多花黄精中多糖和薯蓣皂苷的生合成途径;(4)基于转录组测序数据,筛选表达量高的酶基因Pc UER1进行基因克隆,同时设计特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测条带大小;将明亮的DNA条带经琼脂糖DNA凝胶回收试剂盒处理后,用p GM-T Fast克隆试剂盒进行重组质粒构建,将包含目标基因的载体以热休克方法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养,培养出的菌落经colony PCR确认后,在LB+Amp培养基中进行培养,培养菌群再次经colony PCR确认目标基因后,用小规模提取质粒法提取质粒,在确定质粒浓度后对质粒进行测序,并对获得的目标基因c DNA进行生物信息学分析;从模板质粒Pc UER1中扩增基因Pc UER1,通过酶切位点5’Bam HI和3’Xho I将基因克隆重组至含Kan的载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒Pc UER1 in p ET-28a(+)。结果:(1)通过对多花黄精的叶绿体全基因组测序,得到155 650 bp全长序列,共有7.04 Gb的数据;IR重复区域长度为25 526 bp、长单拷贝区(LSC)长度为86 177 bp、短单拷贝区(SSC)长度为18 421 bp;共注释叶绿体基因132(软件t RNAscan-SE注释)个或135个(软件ARAGORN注释)。(2)据对药用黄精三个种质的叶绿体基因组全长序列,找出多花黄精叶绿体基因序列在153809 bp和155 360 bp存在特异性变异位点;并根据阻滞变异原理分别设计正反向引物PCY1-F和PCY1-R,电泳检测得到1 507 bp的明亮条带,可将多花黄精与黄精、滇黄精有效鉴别。(3)通过对多花黄精根、根茎、茎、叶等部位的转录组测序得到42.03 Gb数据,组装去冗余后得到137 233个unigenes;根据多花黄精转录组数据得出有关多花黄精多糖和薯蓣皂苷两条生源合成路径,其中参与多花黄精多糖的合成路径主要有β-呋喃果糖苷酶(INV)、己糖激酶(HK)、UDP-葡萄糖脱水酶(RHM)及3,5-异构酶/4-还原酶(UER1)等14种关键酶参与;参与薯蓣皂苷合成路径的关键酶有法尼基焦磷酸合酶(FDPS)、法尼基转移酶(FDFT1)、角鲨烯单加氧酶(SQLE)和环烯醇合成酶(CAS1)等,此研究为下游多花黄精多糖和薯蓣皂苷的生物学研究提供可靠的理论参考。(4)筛选出的高表达酶基因Pc UER1经基因克隆得到其c DNA序列全长900 bp,编码299个氨基酸,蛋白分子量约33.5 k Da;经生信分析,得出推测的氨基酸二级结构主要是α-螺旋,其次是无规则卷曲,β-转角结构最少;推测的氨基酸三级结构与模板匹配的结果中有281个氨基酸配对成功,占总数的93.98%,表明该结构与二级结构吻合。经重组构建后的质粒DNA,可为后续诱导重组蛋白表达及重组蛋白功能验证奠定基础,也为多花黄精的重组蛋白的功能验证及各组织中的表达情况提供了丰富实验数据。结论:(1)通过对多花黄精叶绿体全基因组的Illumina测序,获得叶绿体基因全长序列,为设计并筛选特异性引物提供可靠的数据基础;(2)基于叶绿体基因数据,设计并筛选出一对特异性引物序列,可快速鉴别药用黄精种源的多花黄精,对其有效鉴别具有重要意义;(3)优选多花黄精的RNA提取方法,将检测合格的RNA样品用于后续的RNA-Seq,基于转录组学数据对多花黄精不同组织的基因表达进行分析和功能注释,并推测多花黄精中多糖和薯蓣皂苷合成路径,为下游筛选高表达多糖合成关键酶基因提供可信的数据资料,同时也对多花黄精中薯蓣皂苷的后续研究提供帮助;(4)基于多花黄精多糖合成路径中的关键酶基因表达量的转录组数据,筛选出Pc UER1酶基因,经相应转化并构建重组载体后以得到后续可表达的重组蛋白,为进行蛋白表达做准备,同时为多花黄精的蛋白组学研究提供实验基础和参考。