病原菌在侵染宿主时,一方面要获取一定的营养供给,另一方面也要确保自身在侵染过程中能够成功逃逸宿主免疫系统的清除。这些功能的实现,就主要依赖于细菌的分泌系统来完成。分泌系统所涉及的蛋白,包括细菌合成后储存于自身细胞中或细胞表面,或者是分泌到周围环境中,再或者是注入宿主细胞体内,这些分泌蛋白参与了细菌诸多的生物过程,如,细菌侵染时的毒力,鞭毛合成及功能的实现,对宿主相关系统的改造和利用以及对药物的抗性等。目前,在作为动植物病原菌的革兰氏阴性菌中,已发现7种相关的分泌系统,依次命名为T1SS至T7SS1-3。这些分泌系统可大致分为一步或者两步分泌系统,其中,一步分泌系统包括T1SS, T3SS和T4SS,它们一般直接通过一个导管穿过细菌的外膜;两步反应的分泌系统,其底物蛋白需要先通过一股的分泌途径(Sec translocon)或者是双-精氨酸转运途径(Tat),转运跨过内膜进入周质空间,第二步,将N端信号序列切除,底物蛋白被转运出细胞,二步分泌系统包括T2SS和T5SS。与上述几种分泌系统相比,关于T6SS的组装和生物合成,我们还知之甚少。有研究组,已定位一个包含15-20个保守开放阅读框的基因簇,这个基因簇被认定可用来编码T6SS(?)结构组件蛋自。一般认为,T6SS由13个作为核心组件的亚基形成一个微型装置(minimal apparatus),这些核心组件还可再与其它蛋白存在相互作用。这些核心组件中,有一些与噬菌体尾部,剌突,鞘或者基板等相似的结构,另一些蛋白可插入到内膜或外膜上,从而将这个噬菌体样结构锚定在细胞外膜上。现在,普遍的模型认为,这些核心组件共同形成一个可锚定在细菌外膜上的倒转的噬菌体样结构。同时,在T6SS (?)膜上相关蛋白中,鉴定出与T4SS相似的组分,提示我们,T6SS可能是T4SS和噬菌体尾管组成的镶嵌体。Joseph D. Mougous研究组,在铜绿假单胞菌中鉴定了三个T6SS底物(或称效应蛋白),依次命名为Tse1-3(type six exported1-3)。Tse2被鉴定为毒素-免疫体系的毒素成分,输入至缺乏相应免疫抑制蛋白的受体细胞细胞质中,以目前尚且未知的机制,引起宿主细胞的生长停滞,从而保证铜绿假单胞菌在微环境中的生长竞争优势。Tsel和Tse3定位于受体细胞的周质空间,可降解受体细胞细胞壁。同时,铜绿假单胞菌就需要进化出一套相应的可抑制自身Tse作用的免疫蛋白Tsi (type Ⅵ secretion immunity protein),从而成功避免其被自身的Tse所损伤。该研究组用Tse1和Tse3处理提取的Escherichia coli细胞壁,并对酶解产物进行HPLC-MS分析,实验数据证明Tsel具有酰胺酶(DL-内肽酶)活性,属于Tae(type VI amidase effector)超家族,作用位点为肽聚糖γ-D-Glu-L-meso-diaminopimelic acid (γ-D-Glu-m-DAP)间的肽键；Tse3具有溶菌酶活性,水解糖主链上N-乙酰胞壁酸(MurNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)间的β-1,4糖苷：键。结构生物学,研究生物大分子的性质以及分子之间的相互作用,其优势在于,在结构决定功能的理论指导下,获得大分子的三维空间结构,可以帮助我们更好地理解大分子的生物学功能,以及发现它未曾被揭示的功能。Tsi2结构的解析,是研究T6SS效应蛋白-免疫抑制蛋白结构和功能的第一步,但是Tse2-Tsi2复合物的结构尚未解析,因此阐明铜绿假单胞菌T6SS效应蛋自-免疫抑制蛋白的相互作用机制,以及诠释T6SS这个精密转运机器的运转机制,依然有很多相关工作要继续。本文研究目的和研究内容：在功能研究组的工作基础上,本课题借助X射线晶体学手段,我们期望通过解析Tse1单体,Tse3单体,Tse1-Tsi1复合物和Tse3-Tsi3复合物三维结构,最好还能获得Tse与底物肽聚糖的复合物结构,并结合相关生化佐证实验,更好地从分子层面阐释Tse1和Tse3对抗与其竞争的革兰氏阴性菌以及可成功保护自身的机制,同时建立一个可较全面解析T6SS攻击宿主细胞的普遍的模式框架,并为最终控制和预防铜绿假单胞菌感染,提供新的靶向治疗视角。具体研究内容如下‘：1)解析Tsel及Tse1-Tsi1复合物的三维结构,分析其相互作用界面,识别机制及Tsi1抑制Tse1洗胺酶活性的分子机理,并分析Tsi1与Tse1高特异性相互作用的机制。我们解析了Tse1单体和Tse1-(6-148)-Tsi1-(20-end)复合物结构,分辨率分别为1.4A和1.6A(1A=01nm)。2)在大肠杆菌细胞周质空间中转入Tse1表达载体并诱导其表达,进行大肠杆菌生长曲线测定,验证Tse1对大肠杆菌(革兰氏阴性菌)细胞壁的降解作用。3)通过活性中心关键氨基酸残基突变,分析Tse1催化机制,验证其酰胺酶活性。本课题的创新点如下：1)通过Tsel三维结构分析,表明Tsel是NlpC/P60超家族成员,有一个进化上保守的催化中心和结构核。Tse1序列上并无可调节自身活性的序列,提示其更具破坏性和杀伤力。2)不同于已解析三维结构的NlpC/P60家族的其他成员,Tse1空间结构中有四个反平行β-折叠片,而一般的NlpC/P60则拥有5个。代替第五个反平行β-折叠片,是一个可与Tsi1相互作用的功能性loop,进化上使其与Tsi1的抑制功能相适应。3)Tse1单体全结构是个包括花瓣和花萼的花样(flower-like)结构,其中两个裂沟形成一个Y型的活性位点凹槽,区别于NlpC/P60家族经典的V型活性位点凹槽。催化中心的第三个氨基酸是半胱氨酸残基,并且在功能L是非必需的,这也区别于已解析三维结构的NlpC/P60家族的其他成员。也就是说,Tsel反应中心是个催化二联体,而不是NlpC/P60家族经典的催化三联体。4)在保守的Gly67后插入了一个helix,表明Tsel虽然在进化上属于NlpC/P60超家族,但是其通过突变和插入获得了新的特性。5)Tsi1在序列上,与半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的木瓜蛋白酶抑制剂几乎无同源性。6)Tsi1采用全β-片折叠,形成一个半β-螺旋桨样(P-propeller-like)结构。Tsi1结构中,连接β-片的功能性loop类似于5个指头,可与Tsel相互作用,其中位于HI loop的Ser109可直接与Tse1反应中心氨基酸残基相互作用。Tsi1采用的是更特异和更紧密的五指接触模式来抑制Tsel,区别于已发现的经典的半胱氨酸蛋白酶抑制剂与酰胺酶的三部分(三指)相互作用模式。7)通过Tsil-Tsel与cystati n-peptidase(如stefin A-cathepsin H)结构比对,表明Tsi1采用更多的分子间H键,更多的功能性loop和更大的接触表面来抑制Tsel的酰胺酶活性。提示我们,Tsil-Tsel间这种区别于一般的半胱氨酸蛋白酶抑制剂-酰胺酶的高特异性和高紧密的相互作用模式的趋同进化(converged evolution),可能是铜绿假单胞菌细胞代谢循环中细胞壁冉循环所必需的。另外本文,也初步研究了Tse3, Tsi3和Tse3-Tsi3复合物的蛋自纯化,晶体生长优化,以及Tse3母体蛋白晶体衍射数据的收集。