随着人口结构老龄化的到来及社会经济发展带来的国民生活方式的改变,心脑血管疾病的发病率呈逐年增高趋势。我国脑血管病患者约有1300万,以缺血性卒中为主,在各类心脑血管疾病中居首位。缺血性卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率等特点,给家庭和社会带来了沉重的负担。随着卒中免疫生物学概念的提出,大量的研究表明免疫炎症反应是缺血性卒中病理过程中非常重要的一环,卒中后脑组织局部及全身免疫系统反应影响着卒中患者的预后。近年来有文献报道中枢神经系统的炎症反应受控于脑组织细胞间具有免疫调节功能的蛋白的相互作用。白细胞分化抗原200（cluster of differentiation 200,CD200）是位于细胞表面的糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF）,具有典型的V/C2结构域,含有分子量为41 kDa和47 kDa的两个IgSF结构域。在小鼠体内,CD200在胸腺细胞、活化T细胞、B细胞、树突状细胞、血管内皮细胞、肺泡内皮细胞、肾小球细胞、平滑肌及滋养层细胞以及中枢神经系统的神经元均有表达。其受体CD200R（CD200receptor,CD200R）表达较为局限,在外周主要表达于髓系细胞,在中枢神经系统中CD200R则表达于小胶质细胞。CD200可通过与CD200R结合调节髓系细胞活性,对不同组织中的巨噬细胞谱系传递抑制信号。CD200-CD200R调节免疫炎症反应的研究在许多系统的疾病中均有报道,主要涉及的是自身免疫炎性疾病和感染性疾病。在中枢神经系统中,这一对免疫调节蛋白在阿尔茨海默病、帕金森病及多发性硬化等疾病中均有研究报道,关于CD200在实验性脑梗死研究的报道则较少。众所周知,大脑虽然仅占体重的2%-3%,但其血流量却占心脏每分钟输出量的15%-20%。除此之外,大脑还需要依赖持续的血供以获得氧和葡萄糖供应来维持正常代谢。一旦发生缺血性卒中会导致不可逆的脑损伤,脑血流的中断以及再灌注会导致一系列的细胞与分子的级联反应事件造成缺血区功能障碍。缺血后的神经细胞死亡的机制已经得到较为深入的研究。神经元最初是由于失去氧糖供应发生能量衰竭。神经元细胞无法进行有氧代谢来产生足够的ATP维持离子泵的功能,从而导致大量的Na⁺、Ca²⁺在细胞内聚集,细胞内外离子浓度梯度无法维持导致细胞进入过度去极化状态,进而发生细胞肿胀和细胞器变性,细胞膜完整性遭到破坏而失去功能。最终神经元无法耐受缺血缺氧,细胞发生溶解坏死。小胶质细胞作为表达CD200R的中枢神经系统固有免疫细胞,参与脑组织缺血后急性期与恢复期病理生理的全过程。小胶质细胞可通过识别损伤神经细胞释放的信号进行迁移,负责梗死区域的细胞吞噬、清理。然而在急性期,过度激活的小胶质细胞也会加重炎症反应,造成缺血脑组织的二次损伤。本课题关注脑梗死急性期过程,采用健康成年雄性CD-1小鼠为研究对象,用线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞（permanent middle cerebral artery occlusion,pMCAO）模型。首先对梗死后48小时内的脑水肿、脑梗死体积、神经细胞凋亡变化进行观测。然后探讨脑梗死急性期神经细胞凋亡是否影响CD200的表达,以及CD200是否影响小胶质细胞激活和炎症反应。应用干湿重法检测脑水肿、TTC染色法检测梗死体积、流式细胞学技术检测实验性脑梗死小鼠大脑皮层细胞凋亡、免疫荧光染色检测CD200及其受体CD200R在皮层的表达定位,western blot检测梗死后CD200表达的变化,并通过皮尔森相关分析对梗死后皮层细胞凋亡和CD200的表达进行统计学分析;采用脑室内注射CD200重组蛋白（Recombinant CD200,rCD200）,观察外源性补充rCD200后Iba-1及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10和紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin的表达变化。在本研究中,我们采用同源的组织样本分别进行流式凋亡检测和CD200表达检测,使两部分数据可以进行皮尔森相关性分析,验证了皮层细胞凋亡和CD200表达的关系。通过外源性补充rCD200对脑梗死小鼠脑组织炎症因子表达变化进行验证,探讨缺血性卒中的病理过程,为临床治疗寻找新思路提供理论支持和实验依据。本研究分为三部分,各部分内容概述如下。第一部分pMCAO模型小鼠急性期病理过程的动态观察目的:观察实验性脑梗死小鼠在造模后6 h、12 h、24 h和48 h的脑组织含水量、脑梗死体积和皮层细胞凋亡变化。方法:实验一:将CD-1小鼠随机分为5组:对照组（0 h）和实验组（6 h、12 h、24 h及48 h）,实验组线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型并分别于造模后6小时、12小时、24小时及48小时取脑组织标本,干湿重法检测脑组织含水量。实验二:分组同前,实验组线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型并分别于造模后6小时、12小时、24小时及48小时取脑组织标本,TTC染色测定脑梗死体积变化。实验室三:流式细胞术检测皮层细胞凋亡。首先采用机械法处理正常小鼠大脑皮层组织,neuron-specific enolase-Cy5.5（NSE-Cy5.5）染色,IgG作为同型对照,以验证取材方法是否可行,皮层细胞神经元比例与文献报道是否一致。然后线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。分组同实验一,各组分别取梗死侧（右侧）大脑皮层组织,部分做凋亡检测,部分留存做蛋白检测。采用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测梗死后皮层细胞凋亡。结果:1.脑组织含水量测定显示脑水肿在梗死后6小时已经显著升高,在12小时稍有下降,然后在48小时到达峰值。梗死后四个时间点与正常小鼠相比均有统计学差异（P<0.05）。梗死后6、12、24小时之间无差异,梗死后48小时与6、12、24小时之间的差异有统计学意义（P<0.05）。2.TTC染色结果显示,梗死后6小时梗死灶边缘不清晰,12小时界限明显且梗死体积趋于稳定并与24小时、48小时梗死体积变化差异无统计学意义。3.机械法处理皮层组织取材结果稳定、可重复性较好,6个样本NSE-Cy5.5染色阳性细胞数为68.57±4.89%,皮层神经元细胞比例与文献报道的啮齿类动物相一致,可按照此取材方法进行后续实验。AnnexinV-FITC/PI染色结果显示,与对照组相比,各时间点的皮层细胞早期凋亡率和细胞总死亡率（即早期、晚期凋亡及细胞碎片占比之和）与对照组相比,均有统计学差异（P<0.05）。梗死后的皮层细胞早期凋亡率在pMCAO后24小时达到高峰（P<0.05）,总死亡细胞在pMCAO后6小时、12小时、24小时及48小时四个时间点之间的差异无统计学意义（P>0.05）。第二部分pMCAO模型小鼠大脑皮层CD200表达的检测及其与神经细胞凋亡的相关性分析目的:验证CD200及其受体表达在正常小鼠皮层定位,检测梗死后6 h、12 h、24 h和48 h的CD200蛋白表达,完成皮层细胞凋亡与CD200蛋白表达的皮尔森相关分析。方法:实验一:采用健康成年雄性CD-1小鼠为研究对象,通过CD200与Iba-1共标、CD200与NeuN共标、CD200R与Iba-1共标免疫荧光染色,进行正常小鼠皮层的CD200定位检测。实验二:Western bolt对第一部分实验中进行皮层细胞凋亡检测的同源组织进行CD200及神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）蛋白表达检测,并通过统计学方法对小鼠梗死后皮层细胞凋亡与CD200蛋白表达进行相关性分析结果:1.CD200染色阳性呈环形,且与NeuN表达共定位。CD200阳性区域与Iba-1没有重合,与Iba-1阳性呈区域毗邻关系。CD200R阳性区域呈现不规则形状且与小胶质细胞呈部分共定位。2.Western blot结果显示梗死后皮层CD200蛋白表达下降,其中梗死后12小时下降水平除与对照组有统计学意义外（P<0.05）,其与梗死后6小时比较也具有统计学差异（P<0.05）。3.皮尔森相关性分析显示皮层细胞早期凋亡与CD200蛋白表达不具有相关性（P=0.139）,细胞总死亡数与CD200蛋白表达呈负相关（P=0.03,r²=0.50）。第三部分侧脑室注射rCD200对pMCAO小鼠皮层组织炎症因子与紧密连接蛋白表达的影响目的:造模后立即行侧脑室注射（Intracerebroventricular injection,ICV）rCD200蛋白,观察外源性rCD200对Iba-1和炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10,以及紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin表达水平的影响。方法:线栓法建立小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型。将CD-1小鼠随机分为:溶剂组（saline组）和重组蛋白组（rCD200组）造模后立即进行侧脑室注射。对照组侧脑室注射生理盐水5μl,rCD200组侧脑室注射rCD200 5μl（浓度为1μg/μl）。实验一:saline组和rCD200组分别在造模后6小时、12小时、24小时、48小时取缺血侧皮层脑组织。采用western blot检测CD200及Iba-1的表达。实验二:ELISA试剂盒检测saline组与rCD200组梗死后48小时内TNF-α、IL-1β、IL-10的表达。实验三:saline组和rCD200组分别在造模后6小时、12小时、24小时、48小时取缺血侧皮层脑组织,采用western blot检测Claudin-5、Occludin的表达。结果:1.Western blot分析显示:与saline组相比,rCD200组CD200的表达在梗死后6小时、12小时、24小时和48小时均高于saline组（P<0.05）,说明CD200在梗死后表达下降的情况得到改善。除此之外,在这四个时间点rCD200组的Iba-1表达较saline组均降低。2.ELISA结果显示rCD200组的TNF-α、IL-1β、IL-10表达水平在梗死后48小时较saline组均降低（P<0.05）。3.Western blot分析显示:与saline组相比,rCD200组紧密连接蛋白Claudin-5、Occludin的表达变化无统计学差异。结论:1.实验性脑梗死小鼠急性期脑组织水肿变化呈双峰,在梗死后6小时明显升高,梗死后12小时稍有下降,并在梗死后48小时达高峰。脑梗死体积在梗死后6小时已出现,12小时后不再发生明显变化。早期凋亡细胞数则在梗死后24小时最高,而总死亡细胞数在梗死后四个时间点处于相对平稳的状态。2.CD200在中枢神经系统表达于神经元细胞;实验性脑梗死小鼠的皮层CD200蛋白表达水平与皮层细胞总死亡率呈负相关。3.侧脑室内注射外源性rCD200蛋白可改善梗死后CD200表达降低的现象。rCD200还可降低梗死后脑组织Iba-1及炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10的表达。除此之外,rCD200蛋白对组成血脑屏障的紧密连接蛋白Claudin-5和Occludin表达无明显影响。