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J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)是一种典型的致瘤性逆转录病毒,该病毒基因组主要编码三个基因,即病毒衣壳蛋白(gag)、聚合酶(pol)和囊膜蛋白(env)。ALV-J侵染宿主细胞时,首先吸附到细胞特异性受体进入细胞浆,ALV-J自身所携带的反转录酶介导病毒从基因组RNA逆转录成前体病毒DNA,然后整合到宿主细胞基因组中利用宿主RNA聚合酶转录生成新病毒RNA,并进一步翻译生成病毒的各种前体蛋白和以及装配病毒粒子的成熟蛋白质,最后通过出芽的方式释放到胞外。ALV-J从吸附到脱壳(出芽)需要经历了复杂的生理过程;同时,ALV-J和其他病毒一样,基因组结构比较简单,缺乏自身复制所需的完整酶系统,所以ALV-J在复制过程中需要劫持对自身有利的宿主蛋白,利用宿主蛋白的相关功能和特性来完成自身复制,但是,参与ALV-J复制的相关宿主蛋白至今鲜有报道。为了明确对ALV-J复制起关键作用的宿主蛋白,本研究通过蛋白质组学(Tandem mass tag,TMT)方法来筛选相关差异表达蛋白。首先对ALV-J感染的DF-1细胞和正常DF-1细胞的蛋白样品进行质谱分析并标记两组蛋白样品中差异表达蛋白,然后将两组数据中的差异表达蛋白进行生物信息学分析,发现胶原三螺旋重复蛋白1(Collagen triple helix repeat containing 1,CTHRC1)的激活可能与ALV-J复制存在着密切联系。为了进一步确证ALV-J对CTHRC1的促进作用,本实验建立了ALV-J感染的体外细胞模型和ALV-J先天感染鸡胚模型。通过qPCR、western blot和ELISA进行检测,结果显示ALV-J感染能够促进细胞内CTHRC1 mRNA以及蛋白内和细胞外CTHRC1蛋白的表达;同时,IHC结果证明:ALV-J感染能促进鸡体内各器官CTHRC1蛋白表达。以上结果表明,无论是体外还是体内ALV-J感染都能激活CTHRC1的表达。ALV-J感染能够特异地激活CTHRC1的表达,CTHRC1的高表达是否对ALV-J复制有利?为了明确CTHRC1表达量和ALV-J复制的关系,本研究构建了CTHRC1过表达和干扰质粒。结果发现,过表达CTHRC1后CTHRC1表达量升高的同时ALV-J载量也显著上调;而转染shRNA后CTHRC1表达量与Mock组相比显著下调,同时ALV-J载量也显著降低。因此,证明了ALV-J复制需要CTHRC1的参与;同时ALV-J载量因CTHRC1表达量的升高而升高,两者呈正比例相关。上述试验说明CTHRC1和ALV-J之间存在着密切的联系,然而两者是否存在互作关系还不得而知。为了验证两者的互作关系,本研究通过免疫共沉淀和激光共聚焦试验加以验证。在免疫共沉淀试验中,本试验以ALV-J SU蛋白单克隆抗体1D4作为诱饵来沉淀CTHRC1,沉淀产物经western blot分析发现两者存在互作关系。同时激光激光共聚焦结果也发现,在ALV-J感染的细胞中,ALV-J和CTHRC1的亚细胞定位都在细胞浆中,并且两者荧光信号能够重叠在一起产生黄色荧光,激光共聚焦试验也辅助说明两者存在互作关系;激光共聚焦试验还发现,在正常DF-1细胞中,CTHRC1主要弥漫分布于细胞核;而在ALV-J感染的细胞,CTHRC1却围绕着细胞核在细胞浆中分布。因此证明CTHRC1是一个穿梭蛋白,CTHRC1的亚细胞定位可以因ALV-J的感染发生从细胞核到细胞浆的变化。综上所述,本研究发现:ALV-J能够显著地激活CTHRC1的表达,CTHRC1被激活后,与ALV-J SU蛋白发生互作促进了ALV-J的复制;同时CTHRC1作为一个穿梭蛋白,ALV-J能够胁迫CTHRC1发生从细胞核到细胞浆的亚细胞定位变化。本研究结果为ALV-J复制的基础研究奠定了坚实的科学基础;为ALV-J生物制品研制提供了新的思路;同时,ALV-J具有显著的慢病毒特性,CTHRC1可以作为ALV-J的一种复制增强剂来应用。