论文部分内容阅读
氨肽酶N（CD13）抑制剂Bestatin是一种从橄榄网状链球菌培养液中发现的小分子肽。研究表明，Bestatin有明确的抗肿瘤活性，临床上Bestatin单药或联用其它药物治疗急、慢性白血病，取得较好的疗效，并且认为Bestatin的抗肿瘤作用主要是增强宿主介导的非特异性抗肿瘤免疫反应。近年来，国外有少数报道Bestatin对肿瘤细胞有直接的作用，但机制未明。本研究试图阐明Bestatin直接抗肿瘤的具体机制，为该药的临床应用拓宽思路；为设计新的抗肿瘤策略提供理论依据和思路。 我们以人急性粒细胞白血病细胞株HL60细胞及人急性红白血病细胞株K562细胞作为研究对象，应用MTT比色法观察了Bestatin对细胞的生长抑制作用。结果发现，Bestatin对HL60细胞和K562细胞具有生长抑制作用，并且呈剂量依赖关系。0.01μg/ml Bestatin即能显著地抑制HL60细胞生长，其在24小时的半数抑制浓度(IC50)为13.03μg/ml。而Bestatin对K562细胞的抑制作用明显地低于HL60，5μg/mlBestatin方可显著抑制K562细胞的生长，400μg/ml Bestatin作用于K562细胞72小时，其抑制率仍小于50％。说明，不同来源的白血病细胞株对Bestatin的敏感性不同，HL60细胞对Bestatin的敏感性明显高于K562细胞。究其原因，可能是由于HL60细胞和K562细胞CD13的表达量不同。我们发现，HL60细胞CD13的表达（70.10％）明显地高于K562细胞（1.58％），显示Bestatin的生长抑制活性与CD13表达之间具有一定的相关性。虽然Bestatin对正常骨髓细胞也具有一定的抑制作用，当100μg/ml Bestatin作用24 ’J’时，对正常骨髓细胞的抑制率为7．8％，但其抑制作用极明显地低7 于对HL60细胞的作用（59．2％）。5 为探讨Bestatin生长抑制机理，我们采用光学显微镜观察细胞形态结构的改变，) DNA凝胶电泳、DNA片段原位末端标记（TUNEL）法及流式细胞仪（FCM）检测研究 bestatan m导细胞凋厂的作用O ase显m，一＆y＃nstam lestatln处埋m hLbU m 胞知Y北q 伽朋柏口耶＆刑的涸十侧胞耶太警功亦 古nm 览防＆协由山皿牲忆胖的i ＊＊A公币门＞召泛宁F＼＊N八 乙a口口＊rJ，＊丈el＊Nc乙了左川、0丕川川’壮地灶巴O9出o巴二三1上】刁山E 乙FlJ1 锻巴佰比M寸矾显不，驻脓St3tlfl处埋后勺业以期细胞群怀出现，Aflfl6XlflV””＊H 2 双染色法扮测细胞膜外侧磷脂酚丝氨酸（PS）的含量，发现Bestatin处理细胞存在＋ PS轩伉。HL60细胞和K562细胞凋亡百分率陋Bestatin浓臣增加及作用时间植长而I 增加。〔怵结果提示，诱导细胞凋亡可能是Bestatin ti肿瘤的重要机制＞一。l l Bestatin处理的细胞 FCM细胞周期分析显示，经 100fig／ml Bestatin作用 6小 时后，HL60细胞S期细胞略上升后下降，GZ期细胞明显下降，而GI期细胞明显上升； 经Bestatin作用12小时后，细胞明显阻滞于GI期。ll 本研究用亲脂性阳离子荧光染料 RhodOllliflC123（o123）对细胞染色，经 FCMD 检测 Bestatin处理前后细胞线粒体膜电位（凸 W。），用发色底物法测定 Bestatin诱R 导细胞凋亡时caspase－3活性的变化；用RTPCR法在转录水平，用Western－blot及1 免疫组织化学技术在蛋白水平检测Bes亡叭 对讹“细胞k卜2，Bax基因表达的影R 响，探讨Bestatin诱导细胞凋亡信号传导的可能途径。】研究结果显示，HL60细胞经 100 119／ml Bestatin作用 12及 24h后分别有110．77％，18．07％的细胞线粒体凸W。下降；10ug／ml Be。tatin作用24h为＊．52％，9 对照为 8．87％。表明经Bestatin处理能使HL60细胞线粒体八 Win下降。HL60细胞经 100 pP／。IBestatin作用 3小时，Cassase－3活性即有上升。随作用时间的延长而逐S 渐升高，至4S ’J’时达到最高峰，然后逐渐下降。表明，caspase－3在这一凋亡过程I 中被激活。加入caspase－3抑制剂AC－DEVD－CHO，能明显地抑制Bestain诱导的细胞【凋亡，迸一步证实在Bestatiri诱导细胞凋亡过程中，caspa。e－3起着重要的作用。12 100pg／ml Bgstatin作用于HL60细胞 0－72刁时，BclZ mRNA表达水平无明显变 化；在一定作用时间范围内，随着Bestatin作用时间?