现代人的不良饮食习惯和生活方式造成了全球糖尿病患病率的惊人增长,糖尿病已成为继高血压之后的第二大类疾病,给患者带来了沉重的生活和经济负担。糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管并发症,也是终期末端肾病首要诱因。糖尿病肾病的特征表现为蛋白尿,肾基底膜增厚、系膜扩张,持续性的肾纤维化和进行性的肾功能下降。糖尿病肾病所带来的肾功能减退不但会缩短患者的预期寿命,还会增加心血管疾病的发病风险,严重影响患者的生活质量。目前,糖尿病肾病的治疗尚无针对性的特效药物,主要通过改善生活方式、控制血糖、控制血压、纠正脂质代谢紊乱等方式来延缓糖尿病肾病的病情进展。因此,糖尿病肾病防治药物的研究具有重要的社会和经济意义。中药在我国具有悠久的历史,各种中药及其提取物对糖尿病肾病的治疗作用已有较多的研究,对中药发挥治疗作用的物质基础和分子机制的探索成为当前研究的热点。冬虫夏草是一味具有补肺益肾效果的传统中药,而通过发酵工艺制备的人工虫草弥补了野生虫草产量的严重短缺,这些野生和人工虫草已被广泛用于包括糖尿病肾病在内的各类肾脏疾病的治疗,并取得了良好的临床效果。目前对冬虫夏草治疗糖尿病肾病的活性组分、作用机制和药用制剂的研究仍然处于起步阶段。多数研究仅停留在冬虫夏草菌粉及其粗提物治疗糖尿病肾病的研究上,而市场上的虫草制剂也仅是填充有虫草粉末的简单胶囊剂。尽管有关虫草多糖的少量研究见诸报端,但是仍然缺乏对冬虫夏草治疗糖尿病肾病的具体活性组分、作用机制和高端制剂的系统性研究。为了进一步探索虫草作为糖尿病肾病防治药物的奥秘,本课题以医药市场上常用的人工虫草为原料药开展了抗糖尿病肾病的人工虫草活性组分分离、活性筛选、作用机制以及改良制剂的研究。本课题的研究内容主要由以下四个部分构成:(1)人工虫草各组分的分离纯化及初步抗糖尿病肾病活性筛选;(2)人工虫草活性组分对实验性糖尿病肾病的治疗作用及机制研究;(3)人工虫草改良制剂的制备及其药物动力学研究;(4)活性成分麦角甾醇纳米制剂的制备、表征及体内药物动力学和体外药效评价。(1)人工虫草各组分的分离纯化及初步抗糖尿病肾病活性筛选本部分的工作重点是对人工虫草中含量丰富且具有良好生物活性的多糖类、核苷类和甾醇类组分(有效部位)进行分离纯化以及初步抗糖尿病肾病活性筛选。多糖类组分是通过水提醇沉法将多糖从冬虫夏草中初步分离出来,再经过Sevage试剂脱蛋白、双氧水脱色、透析法去除小分子物质进行纯化得到纯化的多糖样品。对所制备的人工虫草多糖样品进行质量评价,发现样品中的多糖含量为49.73%(以葡萄糖计),样品中含有糖类物质、不含还原性的单糖和蛋白质。核苷类组分是通过将冬虫夏草水提后分别过大孔树脂柱和葡聚糖凝胶柱而得到纯化后的冬虫夏草核苷提取物(CS-N)。采用LC-DAD法和LC-MS法对样品中的核苷类成分进行了定性和定量分析,鉴定出的10种核苷类化合物分别是尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、鸟苷和胸苷,其中鸟苷含量最高。甾醇类组分通过乙醇提取将甾醇类成分从冬虫夏草中提取出来,然后经过乙酸乙酯萃取、硅胶柱分离、重结晶纯化得到冬虫夏草甾醇提取物。采用LC-DAD法和GC-MS法对甾醇提取物中的甾醇类成分进行分析,结果表明其主要成分是麦角甾醇,含量可以达到92%,故用市售麦角甾醇进行后续研究。对上述人工虫草组分的抗糖尿病肾病活性初筛工作包括体外建模及活性筛选。以高糖诱导的大鼠肾系膜细胞为模型,以细胞外基质性成分纤连蛋白和1型胶原蛋白为筛选指标。初步活性筛选结果表明在三类主要有效组分中核苷提取物和甾醇提取物(麦角甾醇)对细胞外基质表达的抑制作用更为明显。(2)人工虫草活性组分对实验性糖尿病肾病的治疗作用及机制研究鉴于虫草多糖研究的文献报道较多,本课题重点考察了核苷提取物和甾醇提取物(麦角甾醇)对实验性糖尿病肾病的治疗作用,并初步探索了其作用机制。核苷提取物(CS-N)的抗糖尿病肾病研究包括体内外建模以及对作用功效、信号通路的探索。体外研究选择了高糖刺激的HK-2细胞模型,其功效研究结果表明CS-N治疗能够有效抑制高糖诱导的上皮间质转分化和细胞外基质积聚。体内模型为STZ诱导的C57BL/6小鼠模型,CS-N灌胃给药40、80mg/kg/day,连续给药8周。体内研究结果表明,CS-N治疗能够有效恢复糖尿病肾病小鼠的体重,改善其肾功能;高血糖导致的小鼠肾脏细胞损伤、肾小球肥大、系膜扩张和糖原胶原沉积状况在CS-N给药治疗下也得到明显改善;信号通路研究结果显示CS-N给药抑制了 p38和ERK信号通路的活化,进而减轻了上皮间质转分化和细胞外基质的沉积。甾醇提取物(麦角甾醇)抗糖尿病肾病研究中的体内外建模和作用功效与核苷提取物(CS-N)的研究内容相似,主要不同点在于其作用机制的差异。体外研究通过高糖刺激肾系膜细胞构建了糖尿病肾病细胞模型。体外功效研究结果表明麦角甾醇可以抑制高糖诱导的肾系膜细胞异常增殖和细胞外基质性成分的过度表达;作用机制研究发现麦角甾醇能够下调TGF-β1的表达,抑制Smad2的磷酸化水平并调节其下游信号来发挥其抗糖尿病肾病作用。体内研究对STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠灌胃给药麦角甾醇10,20,40 mg/kg/day,连续给药8周。体内研究结果表明,麦角甾醇给药可以增加糖尿病肾病小鼠的体重,改善小鼠胰岛β细胞功能,恢复肾功能;另外,麦角甾醇还能显著改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾组织中肾小球体积增大、系膜基质扩张、肾小管间质损伤以及糖原和胶原沉积的状况;体内的作用机制研究显示麦角甾醇在体内通过与体外同样的信号通路来起到治疗糖尿病肾病的作用。(3)人工虫草改良制剂的制备及其在大鼠体内的药物动力学研究麦角甾醇是冬虫夏草治疗糖尿病肾病的重要活性成分,但水溶性极差,这将影响冬虫夏草口服给药后麦角甾醇从菌粉中的溶解和释放以及在胃肠道的吸收,从而影响口服生物利用度。因此,需要制备一种能够增加麦角甾醇溶解度的人工虫草改良制剂,该制剂的研究工作主要是对增溶剂的筛选。我们首先考察了不同增溶技术对麦角甾醇的增溶作用,测定了麦角甾醇在几种常用增溶剂和潜溶剂中的溶解度;结果表明SDS对麦角甾醇的增溶效果最好,故选择将SDS用于冬虫夏草提取物中制备改良制剂。改良制剂的药代动力学研究包括方法学的建立以及药代动力学参数的考察。我们建立了大鼠血浆中麦角甾醇的LC-MS含量测定方法,方法学验证结果表明所建方法的线性关系良好、专属性强、精密度和准确度高、回收率高、稳定性好,可以用于麦角甾醇的药物动力学研究;在大鼠体内的药物动力学研究表明,人工虫草改良制剂能显著提高冬虫夏草口服给药时麦角甾醇的血药浓度和生物利用度。由此推测,相比于人工虫草菌粉直接给药,人工虫草改良制剂用于糖尿病肾病的治疗可能能够降低给药剂量、提高治疗效果。(4)麦角甾醇纳米脂质载体的制备和评价鉴于麦角甾醇具有良好的抗糖尿病肾病活性,本部分的研究制备了麦角甾醇纳米脂质载体(ERG-NLC),以提高麦角甾醇的溶解度和口服生物利用度。这些工作为后续麦角甾醇相关产品的开发奠定了理论和实验基础。麦角甾醇纳米脂质载体的研究工作包括剂型选择、工艺和处方优化、制剂表征和体内外评价。我们选择生物相容性良好、稳定性高的纳米脂质载体作为麦角甾醇纳米制剂的剂型。制剂的工艺和处方研究以包封率为主要考察指标,对工艺和处方进行了单因素筛选和正交设计优化,最终选择以单硬脂酸甘油酯和癸酰基/辛酰基甘油酯作为脂质材料、以吐温80、Pluronic F68和卵磷脂作为乳化剂、采用乳化-超声法制备ERG-NLC。所制备的ERG-NLC分散液为近澄明有淡蓝色乳光的液体,纳米颗粒呈球形、表面圆整、无粘连,包封率和载药量分别为92.9%和6.51%,粒径为85.72 nm,zeta电位为-30.77 nmV,制剂稳定性良好。为方便包装、储存和运输,通过冻干保护剂的筛选,确定以5%的甘露醇作为冻干保护剂将ERG-NLC制备成冻干制剂。所制备的ERG-NLC冻干产品具有良好的外观和再分散性;质量评价结果表明冻干过程对制剂包封率、载药量、粒径、电位和微观形态影响较小;DSC和X-射线衍射的物相分析结果表明麦角甾醇已被包裹或吸附在纳米脂质载体中,形成了新的物相。以大鼠为药物动力学研究模型,考察口服药物动力学参数的变化;通过MTT法和Western blot法研究ERG-NLC对高糖诱导的RMC细胞增殖和细胞外基质积累的影响。药代动力学和体外药效研究结果表明ERG-NLC显著增加了麦角甾醇的口服生物利用度,增强了其对高糖诱导的肾系膜细胞的增殖和细胞外基质积聚的抑制作用,提高了体外抗糖尿病肾病活性。综上所述,本课题对人工虫草的各组分进行了分离纯化和初步活性筛选,并研究了核苷类组分和甾醇类组分对糖尿病肾病的治疗效果和作用机制:核苷提取物能够通过抑制p38/ERK信号通路的活化来减轻上皮间质转分化和细胞外基质的沉积,麦角甾醇则通过调节TGF-β1/Smad2通路抑制肾系膜细胞的过度增殖和细胞外基质的积聚;针对抗糖尿病肾病活性成分麦角甾醇水溶性差的问题,本课题分别制备了人工虫草改良制剂和麦角甾醇纳米脂质载体:人工虫草改良制剂能有效提高麦角甾醇的口服生物利用度,麦角甾醇纳米脂质载体显著增加了麦角甾醇的口服生物利用度、提高了其体外抗糖尿病肾病活性。本课题为冬虫夏草抗糖尿病肾病的物质基础和作用机制的研究提供了实验数据,为后期虫草制剂的改良和麦角甾醇相关产品的开发提供了理论和实验依据。