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在头颈部恶性肿瘤的治疗中，尽管手术水平不断提高，但仍有大部分患者需要辅助放疗以提高治疗效果。在放疗过程中，放射线在杀灭残余肿瘤细胞的同时，不可避免地会引起正常组织的损伤。血管内皮细胞对放射线敏感性较高，放疗时容易受到破坏，使得照射区血管尤其是仅由少数内皮细胞构成的微血管发生堵塞，最终引起组织缺血和纤维化。放疗引起的这种组织缺血状态可维持较长时间，甚至可达数十年，这给后期的颅颌面缺损修复带来极大的困难。内皮祖细胞（EPCs）是内皮细胞的前体细胞，出生后定居于骨髓，当组织缺血、损伤或在外源性细胞因子及药物的刺激下，可动员进入外周循环，特异性归巢于受损区域，参与血管的修复和再生。目前EPCs已广泛应用缺血心肌、缺血大脑、缺血肢体以及糖尿病并发症等各种缺血性疾病的治疗研究中，取得了显著的效果。但较少有相关报道将EPCs应用于改善放疗后的组织缺血。因此，本课题拟利用EPCs的特异性血管修复能力，通过在体外观察放疗后微血管内皮细胞（MVECs）的改变及其对EPCs的活化、趋化及粘附作用，以及在体内观察EPCs移植对放疗后组织微血管修复的效果，探讨将EPCs移植用于改善放疗后组织缺血的可行性。1. EPCs和MVECs的培养和鉴定联合使用梯度密度离心法、差速贴壁法和挑克隆法分离培养F344大鼠骨髓EPCs，从细胞表型、超微结构、内吞功能、体外成血管功能和增殖能力等方面对细胞进行检测。结果表明其CD34阳性率为2.45%，CD144阳性率为95.8%，CD31阳性率为80.9%，VEGFR2阳性率为46.6%，vWF表达阳性，细胞能内吞DiI-AcLDL并与FITC-UEA-1结合，胞浆中有Weibel-Palade小体，细胞能在基质胶上形成明显的管腔样结构，增殖能力较终末分化内皮细胞强。以上结果表明所获得的细胞符合EPCs特点，纯度高，增殖能力强。采用组织块法和免疫磁珠分选法分离纯化F344大鼠腓肠肌MVECs，从细胞表型、内吞功能及体外成血管功能等方面对细胞进行检测。结果表明纯化后MVECs CD31表达率为96.6%，vWF表达阳性，desmin表达阴性，细胞能内吞DiI-AcLDL，能在基质胶上形成管腔样结构。以上结果表明实验获得了高纯度的MVECs。2.放疗后MVECs的改变及其对EPCs的活化、趋化及粘附作用对MVECs单次给予20Gy X射线，观察其增殖能力、迁移愈合能力、对VEGF刺激的反应能力及体外成血管能力变化，同时观察趋化因子SDF-1、粘附分子ICAM-1、VCAM-1及E-selectin表达量的变化。结果表明放疗后MVECs基本丧失增殖能力，且迁移愈合能力、对VEGF刺激的反应能力及体外成血管能力均明显降低，但SDF-1、ICAM-1、VCAM-1及E-selectin蛋白及mRNA的表达水平均有上调。将放疗后的MVECs与EPCs非接触性共培养，并进行迁移实验和粘附实验，观察放疗后的MVECs对EPCs的活化、趋化及粘附作用。结果表明放疗后的MVECs可有效促进EPCs CXCR4的表达，促进EPCs的迁移和粘附；与放疗的MVECs预共培养后，EPCs的迁移能力和粘附能力显著提高，故预共培养可作为EPCs体内移植前活化的有效途径；在以上迁移和粘附过程中，SDF-1/CXCR4轴和粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-selectin发挥了重要作用。3. EPCs体内移植促进放疗后组织微血管修复的体内实验研究构建携带EmGFP基因的慢病毒载体，并应用该载体到达标记EPCs的目的。结果表明所构建的慢病毒载体能有效地将EmGFP基因转导到大鼠骨髓EPCs染色体基因组中，标记率达90%以上。通过建立大鼠小腿放疗模型，综合照射区域组织的病理变化、趋化因子及粘附分子的表达情况，筛选出EPCs体内移植的合适时机。结果表明放疗后3周，组织的炎症反应基本消退，但血管尚未见明显的堵塞现象，且该时期照射区域组织中SDF-1的表达量仍保持在相对较高的水平，内皮细胞也可见有ICAM-1、VCAM-1和E-selectin的高表达，可作为EPCs体内移植相对合适的时机。利用已筛选的移植时机，将预共培养的EPCs静脉注射移植入F344大鼠体内，观察其是否能归巢到放疗区域组织中并有效改善照射区的血流灌注量。研究结果表明，移植的EPCs可成功归巢到放疗区组织中，参与微血管的修复，在实验周期8周内能在一定程度上改善放疗后组织的血液供应。综合以上研究结果，我们发现EPCs移植能有效促进放疗后组织微血管的修复，为解决临床放疗后组织缺血的问题提供一种新的思路。