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研究背景:帕金森病(Parkinson disease,PD)是常见的人中枢神经系统退行性疾病,中脑黑质致密部多巴胺(dopamine,DA)能神经细胞慢性进行性变性死亡是PD最主要的病理特征,如何延缓和逆转DA能神经细胞的变性死亡是当前PD研究的重点之一。胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在DA能神经细胞存活和损伤修复中发挥关键作用。神经细胞受到损伤时会应激性启动自身修复性机制,激活细胞内特定的信号转导通路和具有保护作用的基因表达。DA能神经细胞具有表达和分泌GDNF的能力,DA能神经细胞在损伤早期是否同样具有应激保护机制,GDNF是否参与了该种应激性的自身修复?GDNF应激性高表达的机制是什么?氧化应激损伤是PD患者DA能神经细胞变性死亡的重要原因,PD的经典造模药物6-OHDA对DA能神经细胞的损伤主要是氧化应激损伤。研究显示,6-OHDA诱导的损伤早期的大鼠黒质中磷酸化Akt1(phosphorylation of Akt1,p-Akt1)的表达上调。在肿瘤细胞中Akt1可以直接磷酸化眼发育缺失(eye absent,Eya)家族蛋白磷酸酶Eya1使其活化。转录辅助因子Eya1与转录因子正弦眼相关性同源盒2(sine oculis related homeobox2,Six2)共转染可增强Six2的转录活性。且在肾脏发育过程中,Six2能结合于GDNF启动子区促进GDNF转录。我们预实验结果表明损伤早期的DA能神经细胞中Akt1、Eya1和Six2的磷酸化水平均发生改变。那么,在DA能神经细胞早期损伤过程中,akt1、eya1及six2是否介导了gdnf的应激性高表达?本研究拟通过体内外实验,明确6-ohda诱导的da能神经细胞损伤早期是否存在gdnf应激性高表达;gdnf应激性高表达的机制是什么;以及应激性高表达的gdnf可否保护损伤的da能神经细胞。方法:为了观察da能神经细胞损伤早期是否存在gdnf的应激性高表达,首先,在纹状体定位注射6-ohda构建大鼠黒质da能神经细胞损伤早期模型,采用姿势不对称性实验检测大鼠运动能力;荧光定量聚合酶链反应(realtimepolymersechainreaction,qpcr)和免疫印迹(immunoblotting,ib)方法检测gdnf表达。同时,构建离体da能神经细胞损伤模型,采用流式细胞术和ao/eb染色方法检测细胞凋亡;qpcr和ib方法检测gdnf表达;双荧光素酶报告基因检测gdnf的转录活性。为了探讨损伤早期的da能神经细胞中gdnf应激性高表达的机制,首先,采用ib和免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)方法,离体观察损伤不同时间点da能神经细胞中p-akt1、p-eya1及p-six2的表达。同时,构建分别携带akt1、eya1、six2及携带敲减akt1干扰序列(akt1-shrna)、eya1-shrna及six2-shrna的质粒,采用ib和ip方法观察分别过表达/敲减上述基因时,gdnf、p-eya1及p-six2的表达;最后,染色质免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)-qpcr方法,观察six2能否结合于gdnf启动子区促进gdnf转录。为了进一步探讨应激性高表达的gdnf能否保护损伤的da能神经细胞,使用gdnf抗体拮抗损伤早期的da能神经细胞中应激性性高表达的gdnf效应,采用ao/eb染色及台盼蓝染色细胞计数方法观察da能神经细胞的凋亡。结果:1.gdnf在6-ohda诱导的da能神经细胞损伤早期应激性高表达大鼠纹状体部位定位注射6-ohda,处理1d组大鼠的运动能力显著低于对照组,4d和7d组的运动能力高于1d和14d组;1d组黒质中gdnf的mrna和蛋白的表达量显著低于对照组,4d和7d组的表达量显著高于1d和14d组;免疫荧光染色结果显示gdnf表达于大鼠黒质da能神经细胞中。离体结果显示6-ohda处理15min、30min和1h组的细胞凋亡率缓慢增高,6h和12h组凋亡率快速增高;处理15和30min组gdnf的mrna表达量显著对照组,1h、3 h和6 h组的表达量高于15 min、30 min和12 h组;GDNF转录活性与mRNA的变化结果一致;GDNF的蛋白表达量在给药3 h和6 h时也应激性上调。2.Akt1/Eya1/Six2信号通路调控损伤早期DA能神经细胞中GDNF的应激性高表达培养的DA能神经细胞给予6-OHDA作用不同时间时,p-Akt1的表达量在损伤15min、30 min和1 h时应激性上调,p-Eya1的表达量在损伤30min、1 h和3 h时应激性上调而p-Six2的表达量在给药30 min和1 h时显著降低。进一步实验结果显示,过表达Akt1并给予6-OHDA损伤1 h时,GDNF及p-Eya1的表达量升高,p-Six2的表达量降低;敲减Akt1时的结果与此相反。过表达Eya1并给予6-OHDA损伤1 h时,GDNF的表达量升高,p-Six2的表达量降低;敲减Eya1时的结果与此相反。过表达Six2并给予6-OHDA损伤1 h时,GDNF的表达量升高,敲减Six2时表达量降低;此外,ChIP-qPCR结果显示,损伤早期的DA能神经细胞中,Six2通过直接结合于GDNF启动子区促进GDNF的转录。3.应激性高表达的GDNF对6-OHDA诱导损伤的DA能神经细胞具有保护作用培养的DA能神经细胞给予6-OHDA作用2 h时,加入GDNF抗体阻断应激性表达的GDNF效应,结果显示DA能神经细胞的凋亡率显著增高。此外,培养的DA能神经细胞中过表达Six2,然后给予6-OHDA作用12 h时,过表达Six2组的GDNF蛋白的表达量升高,DA能神经细胞的凋亡率降低;同时,大鼠黑质部定位注射携带Six2的慢病毒颗粒,结果显示过表达Six2组的PD大鼠黒质中GDNF的表达量明显增高,且该组大鼠的运动能力得到了改善。结论:6-OHDA诱导损伤早期的DA能神经细胞可通过Akt1/Eya1/Six2信号通路促进GDNF的应激性高表达,从而保护损伤早期的DA能神经细胞。本研究可为寻求PD病人早期治疗的新靶点从而逆转DA能神经细胞的变性死亡提供理论依据。