论文部分内容阅读
目的：
糖尿病微血管病变造成的疾病负担，已成为我国重大公共卫生问题。研究显示生活方式、肥胖、饮食和环境污染是影响糖尿病糖尿病微血管病变发生的重要危险因素，环境因素与遗传因素共同作用导致糖尿病微血管病变的发生，但具体的发病机制仍未探明。循环系统在糖尿病微血管病变的发生发展中起重要作用，环境污染物可通过循环系统到达作用靶点，引起病理性改变，而血红蛋白(hemoglobin，Hb)作为循环系统的红细胞内重要的功能蛋白，微小的周围环境变化就会影响其分子结构、功能等。糖尿病微血管病变患者存在较长时间的血液微环境紊乱，Hb构象与功能可能会受到影响。了解Hb结构和功能的改变有利于探讨Hb与糖尿病微血管病变发生发展的关联性，还为探究其他因素与糖尿病微血管病变发生关联的具体分子机制提供实验依据。
方法：
利用紫外可见吸收光谱和傅里叶变换红外光谱技术检测糖尿病微血管病变患者Hb的光谱，采用病例对照研究方法分析糖尿病微血管病变患者Hb的光谱变化及其影响因素。首先选取性别与年龄匹配的健康人和糖尿病患者作为对照；糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者作为病例组。然后收集一般人口学指标、血脂和血糖水平指标；检测血浆和红细胞还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)，总超氧化物歧酶(Superoxide dismutase, SOD)，丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平用于研究Hb光谱的影响因素。Hb光谱检测方面：用G-75葡聚糖凝胶层析法纯化Hb达到95%以上的纯度，然后利用紫外可见吸收光谱和傅里叶变换红外光谱技术检测Hb的光谱。分析Hb光谱的谱带归属和谱带特征，确定Hb光谱表征的基团与结构。通过与对照Hb光谱的吸收强度、谱带频移、特征谱带比对分析糖尿病微血管病变患者Hb光谱的改变从而推测Hb构象变化。用相关性分析探究血糖控制、血脂水平、氧化应激与Hb光谱吸收强度、构象变化的相关性；以血糖控制水平分层分析糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者Hb光谱变化及其影响因素。
主要研究结果包含了2部分内容：
1.检测健康人、糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的Hb紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱。分析各组Hb紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱间的差异显著性，总结Hb光谱相应谱带的变化。
(1)Hb紫外可见吸收光谱有5个吸收峰，其中276nm为色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭吸收峰，414nm为血红素卟啉环吸收峰，541和577nm分别为α和β亚基。与健康对照、糖尿病患者相比，糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的吸收强度明显降低，血红素卟啉环吸收峰蓝移，最大频移为6nm。糖尿病肾病患者的Hb紫外光谱吸收强度最低，血红素卟啉环吸收峰蓝移最多。提示糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者Hb氨基酸残基含量出现改变，血红素出现扰动，疏水状态改变，导致血红素暴露，Hb携氧功能降低。
(2)Hb傅里叶变换红外光谱有13个吸收峰，与健康对照和糖尿病患者相比，糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的3067cm-1谱带红移，I3304/I3067显著降低，N-H含量相对改变，N-H基团氢键化程度增大；-CH2对称伸缩振动、CH3对称伸缩振动红移，I2963/I2876显著降低，-CH2相对含量增多，CH3含量相对减少，Hb构象发生改变；1655cm-1略微蓝移3cm-1，1541cm-1和1312cm-1最大红移7cm-1，二级结构的氢键遭破坏同时有氢键形成，I1655/I1541降低，构象总体变得疏松无序；1165cm-1谱带蓝移，I1165/I1111显著升高，该基团与其他基团或分子链接的氢键结构遭破坏，CO-O-C基团相对含量增多，导致基团约束力减弱，氨基酸残基构象改变，残基结构稳定性降低。二级结构中子峰蓝移，有序结构α-螺旋含量显著降低，β-折叠结构增多，β-转角和无规卷曲总量增多，Hb二级结构改变提示结构稳定性降低，聚集趋势增加。
2.研究Hb光谱的影响因素，用统计学方法分析血糖、血脂水平和氧化应激与Hb光谱吸收强度和二级结构含量变化的相关性。亚组分析研究糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者血糖控制和氧化应激水平对Hb光谱的影响。
(1)统计分析发现糖尿病微血管病变患者的空腹血糖(Fasting plasma glucose, FPG)，糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c, HbA1c)，甘油三酯(Triglycerides，TG)，血浆和红细胞GSH、SOD水平显著升高，MDA水平显著降低。糖尿病微血管病变患者Hb紫外光谱显示色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭基团、α和β亚基的吸收强度与HbA1c水平呈负相关(|r|＞0.7,P＜0.05)，与红细胞GSH、SOD呈正相关(r＞0.5,P＜0.05)、MDA水平呈负相关(|r|＞0.5,P＜0.05)。二级结构中α-螺旋含量变化与HbA1c，血浆和红细胞MDA水平呈负相关(|r|＞0.4,P＜0.05)。本研究中发现糖尿病微血管病变患者Hb光谱变化与HbA1c、GSH、SOD、MDA水平相关。
(2)从血糖控制目标的实际出发，以血糖控制水平(达标水平为HbA1c＜8%)分层分析老年糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变亚组氧化应激水平与Hb光谱变化的关联性。发现HbA1c＜8%的糖尿病微血管病变患者氧化应激水平明显较低。与未达标患者相比，血糖控制达标的糖尿病视网膜病变患者Hb紫外可见吸收光谱吸收强度较高，α-螺旋含量较高，β-折叠含量较低。血糖控制达标的糖尿病周围神经病变患者Hb紫外光谱α亚基吸收强度较高，α-螺旋含量较低，β-转角含量升高。血糖控制达标的糖尿病肾病患者Hb紫外可见吸收光谱色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭基团、α和β亚基吸收强度升高；红外光谱吸收峰和酰胺I带子峰峰位相近，二级结构含量无显著差异；糖尿病肾病患者Hb结构更为紊乱，提示不仅与HbA1c和氧化应激水平相关。
结论：
1.糖尿病微血管病变患者的Hb紫外可见吸收光谱改变，Hb残基、血红素结构和携氧功能降低。
2.糖尿病微血管病变患者HbFTIR光谱改变，侧链、氨基酸残基、二级结构紊乱，无序结构增多，Hb总体趋向无序。
3.糖尿病微血管病变患者Hb的光谱改变与长期血糖控制不佳(HbA1c水平升高)和氧化应激水平相关。
4.糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病Hb光谱变化不同。
糖尿病微血管病变造成的疾病负担，已成为我国重大公共卫生问题。研究显示生活方式、肥胖、饮食和环境污染是影响糖尿病糖尿病微血管病变发生的重要危险因素，环境因素与遗传因素共同作用导致糖尿病微血管病变的发生，但具体的发病机制仍未探明。循环系统在糖尿病微血管病变的发生发展中起重要作用，环境污染物可通过循环系统到达作用靶点，引起病理性改变，而血红蛋白(hemoglobin，Hb)作为循环系统的红细胞内重要的功能蛋白，微小的周围环境变化就会影响其分子结构、功能等。糖尿病微血管病变患者存在较长时间的血液微环境紊乱，Hb构象与功能可能会受到影响。了解Hb结构和功能的改变有利于探讨Hb与糖尿病微血管病变发生发展的关联性，还为探究其他因素与糖尿病微血管病变发生关联的具体分子机制提供实验依据。
方法：
利用紫外可见吸收光谱和傅里叶变换红外光谱技术检测糖尿病微血管病变患者Hb的光谱，采用病例对照研究方法分析糖尿病微血管病变患者Hb的光谱变化及其影响因素。首先选取性别与年龄匹配的健康人和糖尿病患者作为对照；糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者作为病例组。然后收集一般人口学指标、血脂和血糖水平指标；检测血浆和红细胞还原型谷胱甘肽(Glutathione, GSH)，总超氧化物歧酶(Superoxide dismutase, SOD)，丙二醛(Malondialdehyde, MDA)水平用于研究Hb光谱的影响因素。Hb光谱检测方面：用G-75葡聚糖凝胶层析法纯化Hb达到95%以上的纯度，然后利用紫外可见吸收光谱和傅里叶变换红外光谱技术检测Hb的光谱。分析Hb光谱的谱带归属和谱带特征，确定Hb光谱表征的基团与结构。通过与对照Hb光谱的吸收强度、谱带频移、特征谱带比对分析糖尿病微血管病变患者Hb光谱的改变从而推测Hb构象变化。用相关性分析探究血糖控制、血脂水平、氧化应激与Hb光谱吸收强度、构象变化的相关性；以血糖控制水平分层分析糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者Hb光谱变化及其影响因素。
主要研究结果包含了2部分内容：
1.检测健康人、糖尿病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的Hb紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱。分析各组Hb紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱间的差异显著性，总结Hb光谱相应谱带的变化。
(1)Hb紫外可见吸收光谱有5个吸收峰，其中276nm为色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭吸收峰，414nm为血红素卟啉环吸收峰，541和577nm分别为α和β亚基。与健康对照、糖尿病患者相比，糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的吸收强度明显降低，血红素卟啉环吸收峰蓝移，最大频移为6nm。糖尿病肾病患者的Hb紫外光谱吸收强度最低，血红素卟啉环吸收峰蓝移最多。提示糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者Hb氨基酸残基含量出现改变，血红素出现扰动，疏水状态改变，导致血红素暴露，Hb携氧功能降低。
(2)Hb傅里叶变换红外光谱有13个吸收峰，与健康对照和糖尿病患者相比，糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者的3067cm-1谱带红移，I3304/I3067显著降低，N-H含量相对改变，N-H基团氢键化程度增大；-CH2对称伸缩振动、CH3对称伸缩振动红移，I2963/I2876显著降低，-CH2相对含量增多，CH3含量相对减少，Hb构象发生改变；1655cm-1略微蓝移3cm-1，1541cm-1和1312cm-1最大红移7cm-1，二级结构的氢键遭破坏同时有氢键形成，I1655/I1541降低，构象总体变得疏松无序；1165cm-1谱带蓝移，I1165/I1111显著升高，该基团与其他基团或分子链接的氢键结构遭破坏，CO-O-C基团相对含量增多，导致基团约束力减弱，氨基酸残基构象改变，残基结构稳定性降低。二级结构中子峰蓝移，有序结构α-螺旋含量显著降低，β-折叠结构增多，β-转角和无规卷曲总量增多，Hb二级结构改变提示结构稳定性降低，聚集趋势增加。
2.研究Hb光谱的影响因素，用统计学方法分析血糖、血脂水平和氧化应激与Hb光谱吸收强度和二级结构含量变化的相关性。亚组分析研究糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变患者血糖控制和氧化应激水平对Hb光谱的影响。
(1)统计分析发现糖尿病微血管病变患者的空腹血糖(Fasting plasma glucose, FPG)，糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c, HbA1c)，甘油三酯(Triglycerides，TG)，血浆和红细胞GSH、SOD水平显著升高，MDA水平显著降低。糖尿病微血管病变患者Hb紫外光谱显示色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭基团、α和β亚基的吸收强度与HbA1c水平呈负相关(|r|＞0.7,P＜0.05)，与红细胞GSH、SOD呈正相关(r＞0.5,P＜0.05)、MDA水平呈负相关(|r|＞0.5,P＜0.05)。二级结构中α-螺旋含量变化与HbA1c，血浆和红细胞MDA水平呈负相关(|r|＞0.4,P＜0.05)。本研究中发现糖尿病微血管病变患者Hb光谱变化与HbA1c、GSH、SOD、MDA水平相关。
(2)从血糖控制目标的实际出发，以血糖控制水平(达标水平为HbA1c＜8%)分层分析老年糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病周围神经病变亚组氧化应激水平与Hb光谱变化的关联性。发现HbA1c＜8%的糖尿病微血管病变患者氧化应激水平明显较低。与未达标患者相比，血糖控制达标的糖尿病视网膜病变患者Hb紫外可见吸收光谱吸收强度较高，α-螺旋含量较高，β-折叠含量较低。血糖控制达标的糖尿病周围神经病变患者Hb紫外光谱α亚基吸收强度较高，α-螺旋含量较低，β-转角含量升高。血糖控制达标的糖尿病肾病患者Hb紫外可见吸收光谱色氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸残基共轭基团、α和β亚基吸收强度升高；红外光谱吸收峰和酰胺I带子峰峰位相近，二级结构含量无显著差异；糖尿病肾病患者Hb结构更为紊乱，提示不仅与HbA1c和氧化应激水平相关。
结论：
1.糖尿病微血管病变患者的Hb紫外可见吸收光谱改变，Hb残基、血红素结构和携氧功能降低。
2.糖尿病微血管病变患者HbFTIR光谱改变，侧链、氨基酸残基、二级结构紊乱，无序结构增多，Hb总体趋向无序。
3.糖尿病微血管病变患者Hb的光谱改变与长期血糖控制不佳(HbA1c水平升高)和氧化应激水平相关。
4.糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变和糖尿病肾病Hb光谱变化不同。