禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus, aMPV)，是家禽常见的呼吸道病原之一。aMPV感染火鸡可引起火鸡鼻气管炎，感染产蛋鸡可导致产蛋率下降、孵化率降低。aMPV也被认为是肉鸡肿头综合征(Swollen head syndrome, SHS)的重要诱发因素之一。aMPV于1978年首次在南非报道之后，欧洲、亚洲等地陆续出现该病毒的相关报道。aMPV可以分为A、B、C、D4个亚型，其中A亚型和B亚型在世界各地广泛报道，C亚型和D亚型分别在美国和法国报道。中国大陆地区仅于1999年报道分离到1株禽偏肺病毒；2007-2008年的血清学调查结果显示山东某些地区种鸡血清学阳性率可达100%；2009-2010年，孙静等利用地高辛标记的核酸探针对山东省部分地区临床健康肉鸡群的多种呼吸道病原进行检测，aMPV检出率高达36.87%，而且多重感染现象严重，aMPV对养禽业的危害不容忽视。本研究使用建立的aMPV Nested RT-PCR检测方法，对aMPV进行了分离鉴定，并对分离株的部分特性进行了初步研究，从而为该病的预防控制提供理论依据。本研究内容主要分为两部分：1、禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立和应用本研究根据GenBank上发表的B亚型禽偏肺病毒Fusion (F)基因的保守序列设计两对特异性引物，建立了一种检测B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法。应用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东地区分离株进行检测，能够特异性地扩增出415bp的目的片段。该方法具有高度特异性和敏感性。分别以新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒作为模板进行扩增，结果均为阴性。经过检测，第一次PCR扩增的敏感性为107copies/μL，第二次扩增的敏感性可达到102copies/μL，第二次扩增的敏感性比第一次高105倍。应用该方法对采自山东省不同地区的142份具有呼吸道症状的临床病例进行aMPV检测，最终从中检测出75份为阳性。试验结果表明，建立的逆转录套式PCR检测方法特异、敏感、实用，为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断及深入研究奠定了基础。2、禽偏肺病毒SDWF株的分离鉴定及特性的初步研究从山东省部分地区的商品肉鸡中采集禽偏肺病毒临床疑似病料，并进行RT-PCR检测，筛选出禽偏肺病毒阳性病料作为分毒材料。将阳性病料接种SPF鸡胚，盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞，胚体矮小。取阳性尿囊液在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传代培养，出现禽偏肺病毒典型细胞病变(CPE)：细胞变圆、悬浮，并且有合胞体形成。分离株能够在Vero细胞上生长，并于攻毒后48h左右观察到部分细胞圆缩、悬浮，随培养时间的延长，圆缩的细胞逐渐增多；攻毒72h后可以观察到典型的合胞体。将分离株接种于DF-1细胞，观察到类似细胞病变。采用终点稀释法对病毒液进行初步纯化，并对其进行扩大培养。将病毒液接种于DF-1细胞进行间接免疫荧光试验，可以在胞质中观察到特异的绿色荧光，胞核没有观察到荧光；阴性对照组未出现荧光。对出现典型细胞病变的细胞培养物进行RT-PCR鉴定，可以观察到415bp的特异性目的条带；将PCR产物连接、转化后测序，并与Genbank中发表的F基因序列比较，结果与B亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最高，达97.4%-99.3%；与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低，为77.4%-78.1%；而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低，为69.5%-69.7%。基因分型结果最终显示分离株为B亚型禽偏肺病毒，将其命名为B亚型禽偏肺病毒SDWF株。病毒的核酸类型试验结果表明SDWF株为RNA病毒。血凝试验结果显示分离株不能凝集健康鸡的红细胞以及鸭的红细胞。理化学特性研究结果表明分离株对脂溶性溶剂乙醚、氯仿敏感，为具有囊膜的病毒；对酸性环境有一定的抵抗力；60°C1h可使毒株失活。测定分离株的鸡胚成纤维细胞半数感染量，按照Reed-Muench方法计算SDWF株的TCID50为10-3.3/0.1mL。SPF鸡攻毒试验结果表明，分离株可以引起鸡的呼吸道症状；采集肺脏、气管等脏器做组织切片，显微镜下观察到攻毒组肺脏出现充血、出血以及炎性细胞浸润的现象；气管黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜固有层充血、出血并有炎性细胞浸润；对照组未见异常。