非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及相关纤维化、肝硬化,最终可发展至终末期肝病和肝细胞肝癌。目前,NAFLD已成为全球慢性肝病最常见原因之一。NASH是NAFLD发展为肝硬化和肝癌的中间阶段,被认为是隐源性肝硬化和肝细胞肝癌的一个诱发因素。NASH肝硬化率及病死率显著高于单纯性脂肪变,严重威胁人类健康,逆转及阻断NASH进展具有重大意义。目前NASH的发病机制,尤其是炎症反应的机制尚不清楚,且NASH缺乏有效的治疗手段。因此,探究NASH炎症反应的机制及新的分子靶点具有重要的科研和临床意义。自噬是一种细胞内循环和降解过程,用于调节细胞的存活和耐药性。自噬与NASH炎症密切相关。自噬功能障碍与M1型巨噬细胞极化的慢性炎症相一致,导致从单纯的脂肪变到NASH的疾病进展。肝细胞中,自噬有助于清除受损的线粒体,淬灭细胞内多种炎性因子,发挥抗炎作用。因此,激活自噬可抑制肝脏炎症反应,药物促进自噬可能成为治疗NASH炎症反应的靶点。信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是介导细胞间信号转导的经典转录因子,通过磷酸化Tyr705被激活,移位至胞核,与靶基因结合,主要调控凋亡、中间代谢、参与免疫反应,炎症和肿瘤发生。STAT3作为炎症性疾病的关键介质,在炎症反应中发挥重要作用。STAT3可与NF-κB交互作用,有助于NF-κB活化,上调多种促炎介质,而活化的NF-κB可产生白介素6(interleukin 6,IL-6),进一步激活STAT3,上述正反馈过程,促进炎症发生发展。另STAT3具有自噬调节作用,多种细胞中促进STAT3可抑制自噬,亦有研究表明STAT3可激活自噬。作为炎症和自噬的重要介质,信号传导与转录激活因子3(STAT3)在NASH发病中起到重要的调节作用。但关于非酒精性脂肪性肝炎炎症中STAT3与自噬的关系尚不清楚。二甲双胍(metformin,MET)可改善肝脏疾病的胰岛素抵抗,降低NAFLD血糖、血脂水平,减轻脂质过氧化,具有抑制细胞增殖、抗炎、抗纤维化等作用。大量证据证实二甲双胍具有自噬激活作用。另外二甲双胍抑制多种肿瘤细胞的增殖、转移,诱导凋亡作用均与其抑制STAT3信号通路有关。目前,二甲双胍诱导自噬在NAFLD治疗中的证据主要局限于肝脏脂肪变性,很少有研究关注二甲双胍与STAT3、NASH炎症、自噬之间的关系,二甲双胍对NASH炎症的确切作用和可能机制尚不清楚。我们推测,NASH中,二甲双胍可能通过抑制p-STAT3-tyr750激活自噬,进而抑制炎症反应,降低炎性细胞因子m RNA的表达。综上,本研究中,我们通过NASH患者,动物及细胞实验,应用免疫组化、RNA干扰、q RT-PCR及免疫印迹法等方法,阐述STAT3及自噬在二甲双胍抑制NASH炎症反应中的作用及机制。第一部分STAT3及自噬在非酒精性脂肪性肝炎患者肝组织中的表达特点目的:探讨NASH患者肝组织中STAT3、p-STAT3与自噬抑制是否相关。方法:生化分析仪测定血清谷氨酸—草酰乙酸转氨酶1/草酰乙酸氨基转移酶(glutamate-oxaloacetate transaminase1/oxaloacetate aminotransferase,GOT1/AST),谷氨酸-丙酮酸转氨酶/丙氨酸氨基转移酶(glutamatepyruvate aminotransferase//alanine aminotransferase,GPT/ALT)水平;酶联免疫吸附实验测定血清白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平;免疫组化测定肝组织STAT3、p-STAT3蛋白、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(microtubule-asso ciated protein 1 light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)、SQSTM1(Sequestosome-1,SQSTM1)表达情况;对转氨酶水平与炎性细胞因子表达行相关分析,LC3Ⅱ、SQSTM1表达分别与STAT3、p-STAT3表达行相关分析,阐述STAT3、p-STAT3与自噬抑制是否相关。结果:1.NASH组血清GOT1/AST、GOT/ALT、IL-1β、IL-6和TNF-α水平均明显高于健康对照组。(P<0.0001)2.NASH组肝组织STAT3、p-STAT3、SQSTM1蛋白表达均高于健康对照组,LC3Ⅱ表达低于健康对照组。(P均<0.0001)3.NASH组血清GOT1/AST、GOT/ALT水平分别与IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平正相关。(P均<0.0001)4.NASH组肝组织SQSTM1表达量与STAT3、p-STAT3表达量正相关,LC3Ⅱ表达量与STAT3、p-STAT3表达量负相关。(P均<0.0001)小结:1.NASH患者肝组织STAT3、p-STAT3蛋白表达增加,自噬抑制。2.NASH患者肝组织自噬状态与STAT3、p-STAT3蛋白的表达负相关。第二部分STAT3及自噬在非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝脏中的表达特点目的:探讨NASH小鼠肝组织STAT3、p-STAT3及自噬的表达特点。方法:应用胆碱-蛋氨酸缺乏(methionine and choline-deficient,MCD)饲料喂养C57BL/6J小鼠4周,建立NASH小鼠模型。生化分析仪测定血清GOT1/AST、GOT/ALT水平;荧光定量PCR测定小鼠肝组织STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;免疫印迹(Western blot,WB)法测定STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白的表达情况。结果:1.模型组小鼠肝细胞发生中、重度脂肪变,小叶内大量炎性细胞浸润,部分区域点灶状坏死,窦周或汇管区不同程度纤维化。2.模型组血清GOT1/AST和GPT/ALT水平、肝组织IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA表达水平均明显高于正常对照组。(P均<0.0001)3.模型组肝组织STAT3m RNA、STAT3和p-STAT3蛋白表达均明显高于正常对照组,以p-STAT3增高为著,STAT3活性(p-STAT3/STAT3)增加。(P均<0.0001)4.模型组肝组织与正常对照相比,自噬抑制,SQSTM1蛋白表达增加,LC3Ⅱ蛋白表达下降。(P均<0.0001)小结:1.MCD饲料喂养小鼠4周成功复制NASH小鼠模型。2.NASH小鼠模型肝组织STAT3处于激活状态,活性增加,而自噬抑制。第三部分STAT3及自噬在非酒精性脂肪性肝炎肝细胞中的表达及对炎症影响的机制研究目的:探讨NASH细胞模型中,STAT3、p-STAT3与自噬的表达特点;探讨3-MA自噬抑制对模型中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达的影响;探讨敲低STAT3对自噬及模型中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达的影响。方法:荧光定量PCR法测定细胞中STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;WB法测定STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1的表达水平。转染STAT3 si RNA至NASH细胞模型,检测细胞中STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白表达水平;应用3-MA处理小鼠NASH细胞模型,测定细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;转染STAT3si RNA到NASH细胞模型,检测细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;3-MA+转染STAT3 si RNA到NASH模型,检测细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平。结果:1.MCD培养基处理AML12细胞不同时间后,细胞内脂质聚集及IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA的表达呈时间依赖式递增。2.MCD培养基处理AML12细胞不同时间后,细胞内STAT3和p-STAT3蛋白表达呈时间依赖式递增。3.MCD培养基±氯喹处理AML12细胞24h后,LC3Ⅱ蛋白表达较正常对照组增加,LC3净自噬流明显降低。(P均<0.0001)4.敲低STAT3表达可激活自噬,表现为自噬蛋白SQSTM1表达下降,LC3Ⅱ蛋白表达增加。(P均<0.0001)5.NASH细胞模型+3MA抑制自噬后(MCD+3-MA),细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平较模型组(MCD)明显增加。(P均<0.0001)6.NASH细胞模型中敲低STAT3表达处理后(MCD+si STAT3),细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平较模型组(MCD)明显下降。(P均<0.0001)7.NASH细胞模型中敲低STAT3表达+3-MA处理后(MCD+si STAT3+3-MA),细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平较模型组(MCD)无明显下降。(P均>0.05)小结:1.MCD培养基处理AML12细胞24h,可成功复制NASH细胞模型。2.NASH细胞模型中,STAT3活性增加,STAT3和p-STAT3蛋白表达增高,自噬抑制。3.敲低STAT3激活自噬,抑制NASH细胞模型中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达,3-MA抑制自噬,增加IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达。第四部分二甲双胍对非酒精性脂肪性肝炎炎症影响的机制研究目的:探讨二甲双胍对体内、外NASH模型中STAT3、p-STAT3及自噬的影响;探讨3-MA自噬抑制与二甲双胍联用对NASH细胞模型中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达的影响;探讨敲低STAT3激活自噬,与二甲双胍联用对NASH细胞模型中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达的影响;方法:1.二甲双胍+MCD饲料喂养小鼠4周后,荧光定量PCR法测定肝组织STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平;WB法测定STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白表达水平;2.不同浓度的二甲双胍处理AML12细胞24h后,WB法检测细胞中STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白表达水平;3.20m M二甲双胍+MCD培基处理AML12细胞24h,荧光定量PCR法测定细胞中STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;WB法测定STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白表达水平;4.scramble和si STAT3转染AML12细胞16h后,±MET(20m M)处理24h,WB法测定STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、SQSTM1蛋白表达和p-STAT3/STAT3水平;5.二甲双胍+MCD培基+3-MA处理AML12细胞24h后,荧光定量PCR法测定细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平;6.二甲双胍+MCD培基+STAT3 si RNA处理AML12细胞24h后,荧光定量PCR法测定细胞中IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平。结果:1.二甲双胍降低NASH小鼠模型中STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平,降低STAT3、p-STAT3、SQSTM1蛋白表达水平,增加LC3Ⅱ蛋白表达水平。(P均<0.0001)2.不同浓度二甲双胍处理AML12细胞24h后,细胞内STAT3、p-STAT3及SQSTM1蛋白表达呈剂量依赖式递减,而LC3Ⅱ蛋白表达呈剂量依赖式递增。(P均<0.0001)3.二甲双胍降低NASH细胞模型中STAT3、IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平下降,降低STAT3、p-STAT3及SQSTM1蛋白水平,增加LC3Ⅱ蛋白表达水平。(P均<0.0001)4.二甲双胍明显降低正常对照组AML12细胞STAT3、p-STAT3蛋白表达和p-STAT3/STAT3水平,自噬激活;与MET组比较,MET+si STAT3组STAT3、p-STAT3蛋白及p-STAT3/STAT3水平进一步下降,自噬进一步激活;与si STAT3组相比,MET+si STAT3组STAT3、p-STAT3蛋白及p-STAT3/STAT3水平进一步下降,自噬进一步激活。上述所有变化均具有统计学意义。5.二甲双胍+3MA处理NASH细胞模型后(MET+3-MA+MCD),细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平与MET+MCD组相比,均明显增加(P<0.0001),而与NASH模型组(MCD)相比,均无明显下降,(P均>0.05)。6.二甲双胍+STAT3 si RNA+处理NASH细胞模型后(MET+si STAT3+MCD),细胞内IL-1β、IL-6和TNF-αm RNA表达水平与NASH模型组(MCD)比,均明显下降。(P均<0.0001)小结:1.二甲双胍降低NASH小鼠及细胞模型中IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平,增加STAT3、p-STAT3蛋白表达,激活自噬。2.二甲双胍降低细胞内STAT3、p-STAT3蛋白表达,激活自噬。3.二甲双胍联用自噬抑制剂3-MA时,抵消其降低NASH模型中IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平的作用。4.二甲双胍联用STAT3 si RNA时,增加其降低NASH模型中IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平的作用。结论:1.STAT3和自噬在NASH炎症反应过程中发挥了重要作用。2.NASH患者、小鼠及细胞模型中,STAT3活性增加,STAT3、p-STAT3表达增加,自噬抑制。3.下调STAT3表达,可激活自噬,降低NASH细胞模型中炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平,抑制自噬,增加NASH细胞模型中炎性细胞因子的表达水平。4.二甲双胍可能通过抑制STAT3及p-STAT3表达,激活自噬,降低NASH体内外模型中IL-1β、IL-6和TNF-a m RNA表达水平,抑制NASH炎症反应。5.STAT3和自噬可能成为二甲双胍临床防治NASH炎症反应的新的靶点。