海藻酸盐是FDA批准的被生物医学工程研究人员广泛使用的一种生物材料,通常用作治疗佐剂、药物载体和生物支架,也能够帮助免疫系统激活细胞毒性T细胞抵抗肿瘤。本研究通过海藻酸盐孵育分选的CD8~+T细胞发现该材料促进了细胞毒性T细胞分泌细胞因子IL-2与IFN-γ并增强其在体内外的抗肿瘤作用。通过进一步研究发现海藻酸盐孵育促进了CD8~+T细胞的记忆特性,提高了中央记忆性T细胞CD62L~+CD44~+T细胞(TCM)的比例,从而增强CD8~+T细胞的抗肿瘤免疫记忆作用。在机制上,海藻酸盐通过增加细胞内谷胱甘肽的生成、降低CD8~+T细胞的活性氧水平,进而促进CD8~+TCM细胞的比例。此外,本研究还发现海藻酸盐的组成成分古罗糖醛酸(G单位)具有增加谷胱甘肽和促进TCM的作用。总之,本研究报道了海藻酸盐在清除活性氧和调节细胞毒T细胞功能方面的新功能,提示了海藻酸盐和古罗糖醛酸可能在免疫治疗中用于提高细胞毒T细胞的抗肿瘤功能。第一部分海藻酸盐增强CD8~+T细胞的抗肿瘤作用目的:通过采用含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基培养CD8~+T细胞,探讨海藻酸盐对CD8~+T细胞的活性的影响,检测海藻酸盐对细胞毒性T细胞体内外抗肿瘤作用的影响。方法:⑴从荷载B16-F10恶性黑色素瘤的C57BL/6小鼠中提取外周血淋巴细胞、脾脏细胞与淋巴结细胞,采用流式分选技术将CD8~+T细胞从外周血单个核细胞,脾脏及淋巴结细胞单个细胞悬液中分选出来。⑵采用鲎试剂检测海藻酸盐溶液的内毒素水平。⑶分选的CD8~+T细胞在含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基培养48 h后,采用凋亡试剂盒与台盼蓝染色法分别检测CD8~+T细胞的凋亡率与死亡率。⑷Real-time q PCR、流式细胞术与ELISA检测CD8~+T细胞的细胞因子分泌水平。⑸采用MTS检测CD8~+T细胞在含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基培养48 h后的体外杀伤B16-F10的能力。⑹分别采用C57BL/6小鼠与裸鼠的B16-F10恶性黑色素瘤模型检测海藻酸盐孵育的CD8~+T细胞的体内抗肿瘤作用。结果:⑴通过鲎试剂检测1%海藻酸盐RPMI1640培养基的内毒素,结果显示1%海藻酸盐溶液的LPS水平为0.139EU/m L。⑵通过检测CD8~+T细胞的凋亡率与死亡率发现,含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基对CD8~+T细胞的凋亡与死亡无显著影响。⑶Real-time q PCR、流式检测与ELISA的结果显示,与对照组相比,含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基能够明显促进IL-2与IFN-γ的分泌。⑷体外杀伤实验结果显示CD8~+T细胞在含有1%海藻酸盐的RPMI1640培养基培养48h后,体外杀伤B16-F10的能力显著增加,与对照组相比有统计学差异。⑸C57BL/6小鼠与裸鼠的实验结果显示,与正常对照组和常规CD8~+T细胞治疗组相比,1%海藻酸盐的RPMI1640培养基培养后的CD8~+T细胞能够较强的抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。结论:⑴海藻酸盐能够促进CD8~+T细胞分泌细胞因子IL-2与IFN-γ。⑵海藻酸盐能够促进CD8~+T细胞的体内外抗肿瘤作用。第二部分海藻酸盐促进记忆性CD8~+T细胞比例,增强CD8~+T细胞的抗肿瘤免疫记忆作用目的:通过检测CD8~+T细胞记忆表型、干性相关基因表达水平的变化,探讨海藻酸盐对记忆性CD8~+T细胞亚群与抗肿瘤作用的影响。方法:⑴采用流式分选的方法从荷载B16-F10恶性黑色素瘤的C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞,脾脏细胞及淋巴结细胞单个细胞悬液中分选CD8~+T细胞。⑵采用C57BL/6小鼠的T细胞预治疗模型了解海藻酸盐对CD8~+T细胞体内长期抗肿瘤作用。⑶采用Real-time q PCR与流式细胞术检测CD8~+T细胞的淋巴结归巢相关分子、干性相关基因与调控记忆性CD8~+T细胞分化的转录因子的表达水平。⑷采用流式细胞术检测海藻酸盐对CD8~+T细胞记忆性亚群的影响。⑸采用乌氏粘度计测量不同浓度海藻酸盐与葡聚糖的粘度。结果:⑴采用海藻酸盐孵育的CD8~+T细胞进行肿瘤预治疗的小鼠具有较长的成瘤时间、生存时间与较小的肿瘤体积。⑵Real-time q PCR结果显示CD8~+T细胞表面的CD44、CD62L、CCR7、CD122、c-Kit、ABCB1、Ctnnb1、Runx2等基因的表达水平显著升高,差异具有统计学意义。⑶流式检测结果显示海藻酸盐能够促进CD44+CD62L+CD8~+T(TCM)细胞比例,并随着浓度升高比例逐渐升高,差异具有显著性。⑷海藻酸盐的粘度对CD8~+TCM细胞的比例无显著影响。结论:⑴海藻酸盐具有促进CD8~+T细胞的长期抗肿瘤免疫记忆作用。⑵海藻酸盐能够提高CD8~+T细胞的记忆性标记和相关归巢分子的基因表达。⑶海藻酸盐能够增加CD8~+TCM的比例。⑷海藻酸盐的物理性质对CD8~+TCM细胞的比例无显著影响。第三部分海藻酸盐增强CD8~+T细胞的抗肿瘤免疫记忆作用机制的研究目的:进一步探讨海藻酸盐促进记忆性CD8~+T细胞增多的机制,揭示海藻酸盐增强CD8~+T细胞抗肿瘤免疫记忆作用的内在机制。方法:⑴采用流式分选的方法从荷载B16-F10恶性黑色素瘤的C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞,脾脏细胞及淋巴结细胞单个细胞悬液中分选CD8~+T细胞与CD3+T细胞。⑵采用Real-time q PCR检测培养在含1%海藻酸盐的RPMI1640培养基的人Jurkat T细胞、小鼠CD8~+T细胞与CD3+T细胞抗氧化物酶基因的变化。⑶采用DCFH-DA探针检测海藻酸盐孵育人Jurkat T细胞、小鼠CD8~+T细胞与CD3+T细胞后ROS的水平。⑷采用GSH定量试剂盒检测海藻酸盐孵育人Jurkat T细胞、小鼠CD8~+T细胞与CD3+T细胞后的GSH的含量。结果:⑴含1%海藻酸盐的RPMI1640培养基明显增加人Jurkat T细胞、小鼠CD8~+T细胞与CD3+T细胞的抗氧化物酶基因GCLC、GCLM、GST、CAT、SOD2的表达,降低其ROS水平,增加GSH含量;加入BSO后,人Jurkat T细胞、小鼠CD8~+T细胞与CD3+T细胞的ROS水平明显升高。⑵BSO能够抑制海藻酸盐升高CD62L、CCR7基因表达与增加CD8~+TCM细胞比例的作用。⑶通过分析海藻酸盐的组成成分对CD8~+T细胞的影响,结果发现古罗糖醛酸(G单元)能够促进记忆性CD8~+T细胞比例,增加抗氧化物酶基因CAT、SOD2、GST的表达,降低CD8~+T细胞的ROS水平。结论:⑴海藻酸盐是通过增加GSH的产生以及抗氧化物酶基因的表达从而促进记忆性CD8~+T细胞比例增高。⑵抑制GSH产生能够降低海藻酸盐增加CD8~+TCM细胞比例的作用。⑶通过进一步分析发现,海藻酸盐中的古罗糖醛酸(G单元)也能够促进抗氧化物酶的基因表达升高,从而降低ROS水平,是促进记忆性CD8~+T细胞比例升高的主要成分。