背景近年来，大量有关系统性真菌感染——肺曲霉菌病的免疫研究结果提示，不同的Th(Thelper)免疫应答是影响真菌感染的病程和预后的关键点：Th1免疫应答有利于肺曲霉菌病的愈合，Th2免疫应答则与感染的进展、持续性和慢性化有关，可导致哮喘和过敏性支气管肺曲霉病。但在角膜真菌感染领域，尚未有相关研究。真菌性角膜炎是一种严重的角膜化脓性感染性疾病，因其导致角膜盲甚至眼球丧失而成为全世界眼科领域的一个重大问题。研究Th免疫应答对真菌性角膜炎发展过程和预后的影响，不仅有利于阐明其至今仍未清楚的发病机理，而且能为从免疫学角度开发新的治疗措施奠定理论基础。而要开展真菌性角膜炎Th免疫应答方面的研究，建立合适的动物模型就成为亟需解决的首要问题。BALB／c和C57BL／6是两种实验常用的近交系小鼠，已有的基因背景方面的研究显示两者倾向于不同的Th免疫应答类型，并在有关Th免疫应答的其他疾病动物模型的研究中得到了广泛应用。因此本研究同时采用这两种小鼠，旨在建立该两种小鼠同一种真菌病原的角膜炎模型，观察和比较真菌性角膜炎感染特征、发展过程及其预后的情况，同时调查两种真菌性角膜炎发展过程中真菌病原的繁殖和炎症细胞浸润的演化过程，为进一步分子水平的Th免疫应答的研究奠定模型基础。材料和方法实验动物采用6-8周雌性BALB／c和C57BL／6小鼠，均以右眼为实验眼。真菌病原采用分离自临床真菌性角膜炎病例的野生型茄病镰刀菌的保存菌株，接种浓度为2×10~8CFU／ml(CFU：colony forming unit)。模型制作采用去除部分角膜上皮和浅基质层划伤后表面接种真菌孢子混悬液，以及辅以局部短期激素滴眼液的方法。模型制作后进行三部分研究：1、根据观察时间表，定期采用裂隙灯显微镜观察小鼠真菌性角膜炎病灶特征，并行拍照记录和评分。2、于接种后1、2、3、4、5、7、10和15天分别摘取各实验组小鼠眼球，进行组织病理学检查，包括苏木素-伊红(HE)和过碘酸Schiff(PAS)染色，光学显微镜下观察真菌病原生长方式、炎症细胞浸润和组织坏死情况。3、于接种后6小时，1、2、3、5和7天分别摘取各实验组小鼠眼球行真菌病原量和多核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)浸润量的定量检测。真菌病原量的定量检测采用稀释平板计数法，PMNs浸润量的定量检测采用髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)分析法。实验结果一、小鼠镰刀菌性角膜炎的感染特征、自然病程和预后BALB／c和C57BL／6小鼠实验眼在接种后次日均产生了角膜感染病灶，并且有一个完整的发展过程。1、BALB／c小鼠实验眼的角膜感染特征和病变发展过程绝大部分以基质水肿混浊的发生、发展和逐渐消退为主，不发生角膜穿孔，最后病灶完全消退，不伴基质疤痕和新生血管长入，预后良好。感染高峰期出现在接种后第3天，自然病程持续约10天左右。2、C57BL／6小鼠实验眼的角膜感染特征均依次表现为浸润病灶扩大，化脓坏死和角膜穿孔，最后以血管疤痕组织愈合，甚至出现眼球萎缩，预后差。角膜穿孔发生在接种后第3或4天，自然病程持续约15天左右。二、小鼠镰刀菌性角膜炎发展过程中重要时点的组织病理学表现1、BALB／c小鼠镰刀菌性角膜炎重要时点的主要组织病理学表现可以概括为：真菌病原在接种后第1、2和3天时主要表现为生长范围的扩大，并向深层基质侵袭，直至到达后弹力膜，但未穿透，真菌生长密度均较低；从接种后第4天起，角膜内的真菌病原逐渐减少，并在接种后第7天起完全消失。以PMNs为主的炎症细胞浸润在接种后第2天开始出现，在接种后第3天到达高峰，均呈局灶性团块状分布，在炎症细胞大量浸润的基质内，真菌病原罕见；从接种后第4天起，炎症细胞浸润开始从前向后、由外向里呈向心性逐渐消退，在接种后第10天时完全消失。整个病程中均未观察到坏死组织和基质内新生血管。2、C57BL／6小鼠镰刀菌性角膜炎重要时点的主要组织病理学表现可以概括为：真菌病原在接种后第1、2和3天时主要表现为大量繁殖，生长密度明显增高，并向周围和深层基质扩展，甚至穿透后弹力膜进入前房；在接种后第4天起，真菌病原随着组织坏死的发生而明显减少，在接种后第7天时完全消失。以PMNs为主的炎症细胞浸润在接种后第2天开始出现，散在分布于角膜前中基质的真菌病原之间；在接种后第3天时，炎症细胞浸润明显增多并围绕病原繁殖区形成浓密的细胞浸润带；从接种后第4天起，炎症细胞浸润随着组织坏死的发生而减少，最后完全消失。组织坏死在接种后第3天首先出现于炎症细胞浸润带内，之后坏死不断加重并波及整个病灶，导致大范围后弹力膜缺损和虹膜结构破坏：在接种后第7天开始，坏死组织明显减少并逐渐被纤维血管组织替代。三、小鼠镰刀菌性角膜炎发展过程中真菌病原量和PMNs浸润量的关系在BALB／c和C57BL／6小鼠镰刀菌性角膜炎发展过程中，其各自的真菌病原量和PMNs浸润量的变化发展均呈正相关(BALB／c小鼠组：r=0．684，P=0．002；C57BL／6小鼠组：r=0．755，P<0．001)。但是，两组实验眼中真菌病原量和PMNs浸润量有所不同：接种后第2和第3天，C57BL／6小鼠实验眼中的真菌病原量分别约为BALB／c小鼠实验眼中的2倍(P=0．002)和4倍(P=0．009)；接种后第3、第5和第7天，C57BL／6小鼠实验眼中的PMNs浸润量分别为BALB／c小鼠实验眼中的1．8倍(P=0．022)，2倍(P=0．035)和1．7倍(P=0．040)。结论1、采用去除部分角膜上皮和浅基质层划伤后表面接种真菌孢子混悬液，辅以局部使用短时间的激素滴眼液的方法能成功诱导BALB／c和C57BL／6两种小鼠镰刀菌性角膜炎。2、BALB／c和C57BL／6两种小鼠镰刀菌性角膜炎呈现不同的感染特征、病程和预后。3、组织病理学检查结果显示两种小鼠镰刀菌性角膜炎的真菌病原的繁殖数量和侵袭情况，炎症细胞浸润的分布方式和数量，组织坏死情况，以及眼内结构破坏情况均不同。4、真菌病原和PMNs浸润的定量检测结果揭示两种小鼠镰刀菌性角膜炎发展过程中真菌病原量和PMNs浸润量呈正相关，并且C57BL／6小鼠中的真菌病原数量和繁殖速度，炎症细胞浸润量明显超过BALB／c小鼠。5、真菌接种后1至2天是真菌病原和浸润的炎症细胞相互关系变化发展，继而影响两种小鼠镰刀菌性角膜炎发展过程和预后的关键时段。6、BALB／c和C57BL／6两种小鼠镰刀菌性角膜炎模型可以作为进一步研究真菌性角膜炎Th免疫应答的可供选择的动物模型。