研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是我国常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年上升的趋势。结直肠癌发生的确切原因还不知道,其发生既有先天因素也有后天原因。跟绝大多数肿瘤一样,结直肠癌的发生发展也是一个多基因发生改变的过程。在发病早期,大部分病人可通过手术治愈,但是,因为该病早期症状的不明显性以及易转移性,所以患者大多预后差。因此,加强结直肠癌发生发展及转移机制的基础研究,寻找预防和治疗的有效途径,是结直肠癌研究的重要内容。亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(Leucine-Zipper Tumor Suppressor1, LZTS1)是1999年Ishii等利用微卫星技术对原发性食管癌进行研究时发现的,位于人类染色体8p21.3附近,全长约6.8kb,包含3个外显子。该基因编码一个67kd的亮氨酸拉链蛋白,和依赖cAMP激活的转录因子5的DNA结构域具有相似性。该蛋白是富含亮氨酸重复序列超家族蛋白之一。目前分析主要存在于细胞浆中,少部分位于细胞核。据文献报道,LZTS1基因在人体正常组织中普遍有阳性表达,但在50%以上的肿瘤细胞中有改变,包括膀胱癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胃癌和口腔癌等,说明该基因在多种肿瘤的发生发展中可能起着重要作用。目前认为该基因表达减少或缺失可以由基因突变、染色体缺失、启动子甲基化、组蛋白修饰或其他机制引起,从而引发癌变及肿瘤演进。但对于LZTS1基因在结直肠癌中的研究国内外鲜见相关报道。本实验室长期从事结直肠癌相关的分子机制研究,为了寻找与结直肠癌有关的特异分子标志物,阐明结直肠癌相关的分子机制,我们利用基因芯片分析,发现亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(LZTS1)在结直肠肿瘤组织中表达降低,提示该基因的表达失调很可能与结直肠癌的发生发展相关,并且LZTS1在结直肠癌中的作用及其分子机制并不清楚。本研究旨在初步探讨LZTS1基因在结直肠癌中的作用及其可能的分子机制。材料与方法1、收集南方医科大学附属南方医院2013年3月至2013年10月手术切除的结直肠癌新鲜组织标本及配对的正常结直肠黏膜组织20对,所有标本均经病理诊断确诊为结直肠癌。所有患者术前未接受放化疗。采集前通过南方医科大学附属南方医院医学伦理委员会批准及患者知情同意。2、人结直肠癌细胞株SW480、HCT15、HT29、LS174t、DLD1采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；SW620、HCT116、LOVO、293FT细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞状态良好时用于实验。3、用Real-Time PCR、 Western blot和免疫组织化学检测结直肠癌细胞株、配对结直肠癌及癌旁正常组织中LZTS1的表达。4、采用慢病毒感染的方法构建稳定过表达LZTS1的细胞株(HCT15/LZTS1)和对照细胞株(HCT15/pEZ-Lv105)、以及稳定干扰LZTS1的细胞株(SW480/sh LZTS1)和对照细胞株(SW480/Scramble shRNA)。5、采用MTT实验,平板克隆形成实验,软琼脂集落形成实验检测细胞增殖能力及锚定非依赖生长能力；用Transwell小室侵袭试验检测细胞的侵袭迁移能力；裸鼠皮下成瘤实验观察结直肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。6、用Real-Time PCR和Western blot检测AKT、Wnt信号通路相关分子及EMT相关蛋白标志物的表达。7、采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。8株细胞间△Ct值均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA);结直肠癌组织和正常配对组织间LZTS1平均表达水平比较采用配对样本T检验；MTT实验采用析因设计的方差分析；荧光定量PCR、平板克隆、软琼脂集落形成实验、Transwell (?)、室侵袭实验采用两独立样本的t检验；裸鼠皮下成瘤实验采用one-way ANOVA检验及单个因素重复测量的方差分析。试验数据用均数±标准差(x±s)表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、LZTS1在结直肠癌细胞株中的表达Real-Time PCR和Western blot结果显示,结直肠癌细胞株SW480、SW620、 HCT116、HCT15、HT29、Ls174T、LOVO、DLD1中LZTS1基因在转录和翻译水平都有不同程度的表达,但表达普遍较低,其在HCT15中的表达最低(0.000±0.000),在SW480中的表达最高(0.019+0.001)。2、LZTS1在结直肠癌组织中的表达Real-Time PCR和Western blot结果显示,在10例配对结直肠癌及癌旁正常组织中,癌组织的LZTS1mRNA和蛋白表达均比相应的癌旁组织低,且比值都在2倍以上。采用两配对样本t检验显示差异均有统计学差异。免疫组织化学结果显示,LZTS1在正常肠黏膜组织中有阳性表达,而在结直肠癌石蜡组织中呈低表达或不表达,结直肠癌组织的平均表达水平明显低于配对的癌旁组织。LZTS1阳性表达主要定位于细胞浆,呈棕黄色或黄褐色着色。3、稳定过表达LZTS1降低HCT15细胞的生长增殖和侵袭迁移能力用慢病毒感染的方法将pEZ-Lv105和LZTS1稳定表达在结直肠癌细胞株HCT15中,得到稳定过表达LZTS1的细胞株HCT15/LZTS1及对照细胞株HCT15/pEZ-Lv105。与对照细胞相比,通过MTT实验、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验,证明HCT15/LZTS1细胞的体外增殖能力和锚定非依赖生长能力明显下降。MTT实验结果显示,转染LZTS16天后,HCT15/LZTS1细胞生长速度和对照细胞相比明显减慢(F=125.734,P=0.000)。平板克隆形成实验结果显示对照组细胞HCT15/pEZ-Lv105克隆形成数平均为99.7±11.9个,而HCT15/LZTS1细胞组为49.3±4.9个,差异有统计学意义(t=6.753,P=0.003)。软琼脂集落形成实验结果显示HCT15/pEZ-Lv105细胞形成的克隆体积较大,数目多,克隆形成数平均为26.0±6.1个；而HCT15/LZTS1细胞形成的克隆则体积较小数目也少,克隆形成均数为8.3±2.1个,差异具有统计学意义(t=4.760,P=0.009)。通过Transwell小室侵袭实验显示,HCT15/LZTS1细胞的侵袭迁移能力比对照细胞HCT15/pEZ-Lv105明显减弱。两组细胞的穿膜细胞数分别为：25.7±4.0个,85.3±7.8个。HCT15/pEZ-Lv105细胞侵袭能力是HCT15/LZTS1细胞的3.3倍,差异具有统计学意义(t=11.803,P<0.001)。裸鼠皮下成瘤实验结果表明LZTS1过表达能减弱HCT15细胞在体内的成瘤能力(F=109.093,P=0.000)及皮下瘤的增殖能力。4、干扰内源性LZTS1的表达增强SW480细胞的生长增殖和侵袭迁移能力采用慢病毒介导的方法构建稳定干扰内源性LZTS1表达的细胞株SW480/shLZTS1及对照细胞株SW480/Scramble shRNA。与对照细胞相比,通过MTT实验、平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验,证明被干扰后的SW480/shLZTS1细胞的体外增殖能力和锚定非依赖生长能力明显增强。MTT实验结果显示,干扰LZTS16天后,SW480/shLZTSl细胞生长速度和对照细胞相比明显加快(F=107.696, P=0.000)。平板克隆形成实验结果显示对照组细胞SW480/Scramble shRNA克隆形成数平均为27.7±4.0个,SW480/shLZTS1细胞组为87.0±8.5个,差异有统计学意义(t=10.873,P<0.001)。软琼脂集落形成实验结果显示SW480/shLZTS1细胞形成的集落数明显增多,为45.0+6.2个,对照组细胞SW480/scramble细胞形成的集落数少,为9.7±3.5个,差异具有统计学意义(t=8.542,P=0.001)。通过Transwell小、室侵袭实验显示,SW480/shLZTS1细胞的侵袭迁移能力比对照细胞SW480/Scramble明显增强。两组细胞的穿膜细胞均数分别为：584.0±17.7个,331.7+47.8个,差异具有统计学意义(t=8.582,P=0.001)。裸鼠皮下成瘤实验结果表明沉默LZTS1表达后能增强SW480细胞在体内的成瘤能力(F=39.184,P=0.000),以及皮下瘤的增殖能力。5、LZTS1影响结直肠癌细胞生物学行为可能的分子机制5.1AKT、Wnt/pβ-Catenin信号通路中相关分子标志物的变化Real-Time PCR和Western blot方法检测LZTS1转染前后的细胞株中PI3K/AKT、Wnt/β-Catenin信号通路中相关分子标志物的变化。结果显示：与对照细胞相比,在过表达LZTS1的细胞中,增殖相关分子P21CIP1、P27KIP1和cyclinD1在转录和翻译水平表达均有变化,显示为P21CIP1、P27KIP1表达增高而cyclinD1表达降低。其上游分子p-AKT、p-GSK-3β、non-p-β-Catenin表达降低。相反,与对照细胞相比,沉默LZTS1的细胞中,增殖相关分子P21CIP1、P27KIP1表达降低而cyclinD1表达增高,其上游分子p-AKT、p-GSK-3β、non-p-β-Catenin表达增高。5.2EMT相关分子标志物检测利用Western blot检测EMT相关分子标志物的表达情况,发现与对照细胞HCT15/pEZ-Lv105相比,HCT15/LZTS1细胞上皮分子标志物E-Cadherin、 α-Catenin表达升高,而间质分子标志物Vimentin、N-cadherin表达降低,同时E-cadherin的转录抑制因子snail、slug表达降低。而SW480/shLZTS1细胞与对照细胞SW480/Scramble shRNA相比,上皮分子标志物E-Cadherin、α-Catenin表达降低,而间质分子标志物Vimentin、N-cadherin表达升高,同时E-cadherin的转录抑制因子snail、slug表达升高。以上结果初步说明,LZTS1基因可能是通过抑制Akt,使非磷酸化的活性GSK3p表达增多,进而调节P21CIP1、P27KIP1并(?)cyclinD1的转录,抑制结直肠癌的增殖；同时,非磷酸化的活性GSK3β增多,导致β-catenin磷酸化而降解,β-catenin入核量减少,Wnt途径关闭,又可通过LEF降低cyclinD1的表达,从而进一步抑制结直肠癌的增殖能力。除此之外,LZTS1可能还通过使GSK3β活化增多,下调核内Snail转录因子的表达,促进E-cadherin表达上调,抑制EMT发生,抑制结直肠癌的侵袭转移。但是要明确LZTS1基因在结直肠癌发生发展中的具体调控机制,需要进一步深入的研究和探索。结论1、LZTS1在结直肠癌中表达下调；2、LZTS1可能参与了结直肠癌的发病机制,在结直肠癌细胞的增殖、侵袭转移过程中发挥着候选抑癌基因的作用；3、LZTS1可能通过抑制AKT和经典的Wnt/β-Catenin信号通路对增殖相关分子进行调控,并抑制结直肠癌细胞发生上皮间质转化,进而调节结直肠癌增殖、侵袭、转移能力；4、LZTS1有可能成为判断结直肠癌患者进展及预后的一个新分子标志物,为结直肠癌的预后及治疗提供了新的分子靶点。