角膜缘干细胞(LSCs)是一种可以被用来作为干细胞生物学基础研究的理想材料。迄今为止,LSCs特异性标志物仍未被确立。本文旨在以小鼠为实验动物模型,利用免疫组化、转录组学和蛋白质组学分析,探究LSCs标志物及其干性相关通路。本研究首先通过HE染色观察角膜缘上皮组织学结构,发现了小鼠角膜缘上皮基底中并未存在Vogt氏栅状皱纹(POV)结构,说明小鼠LSCs可能具有自己独特的niche结构。同时,利用角膜上皮细胞(CECs)、结膜上皮细胞和LSCs已知的可能标志物,对小鼠的眼角膜组织进行免疫组化染色,发现LSCs标志物具有独特的空间表达模式,并推测该结果与年龄因素相关。我们遂以出生前和出生后不同发育时间的小鼠角膜、角膜缘组织为样品进行HE染色和免疫组化染色。通过HE染色观察,发现小鼠角膜发育早期以上皮下基质发育为主,在P14眼睑睁开后,光刺激促进角膜上皮发育,转为以角膜上皮发育为主,且在整个发育过程中也均未观察到POV结构。通过免疫组化染色观察,发现LSCs标志物在发育过程中呈动态表达,按照其在发育过程中CECs表达减弱的时间先后顺序排序如下:Vim>p63>CK15>CK14,说明LSCs标志物的表达具有时间特性,其中Vim的表达仅在E19之前可在小鼠眼角膜的上皮细胞膜上被检测到,CK15的表达在P14之后仅在LSCs可被检测到,而p63和CK14则在CECs持续低表达,说明CK15更适合作为P14后LSCs的标志物。我们进一步利用转录组测序和蛋白质组测序进行LSCs标志物的研究。采用Illumina Hiseq Xten对4周龄小鼠角膜及角膜缘组织进行转录组测序,利用qRTPCR验证测序分析结果可靠(相关系数为0.7598),通过差异分析获得1907和395个在角膜缘中分别显著性上调和下调的基因。发现显著上调基因的GO条目与离子转运,组织发育调节,视觉感知和细胞粘附等有关,富集到的KEGG通路中ECM-受体相互作用、PI3K-AKT、MAPK通路参与LSCs干性的维持。我们还利用Label-free LC-MS/MS进行蛋白组学的分析,并通过免疫印迹试验验证测序分析结果可靠。通过差异分析获得804和76个分别在角膜缘中显著性上调和下调的蛋白,基于这些差异表达的蛋白进行免疫组化染色和功能注释。通过免疫组化染色,我们发现3个新的LSCs候选标志物,即ALDH3B2、SLC5A8和HSD17B2。通过基于显著上调蛋白的功能注释分析,发现细胞粘附蛋白和Focal粘附通路对LSCs干性表型的维持具有重要的作用。最后,将转录组和蛋白质组数据进行关联分析,获得相对于角膜组织而言,在角膜缘组织的转录水平和蛋白质水平中表达趋势一致的DEGs和DEPs,其相关性为0.7357(斯皮尔曼系数)。然后利用这些表达趋势一致的DEGs和DEPs进行生物信息学分析,发现细胞的外泌体参与CECs和LSCs的信息交流,且在LSCs niche中,细胞外基质蛋白可能作为关键性节点蛋白通过激活Focal粘附、ECM-受体相互作用、PI3K-AKT通路对LSCs的细胞周期、增殖、分化、迁移和存活等多种干性相关表型的维持具有重要作用。综上所述,本研究首次揭示了小鼠LSCs标志物表达的时间光谱,证明了标志物在LSCs表达所特有的时间性。在未能确定持续性的LSCs特异性标志物的情况下,可以根据不同的生理年龄选择相应的标志物识别LSCs。本研究并还首次基于转录组和蛋白质组测序分析,发现了三个新的LSCs候选标志物及其干性相关通路。这些发现为LSCs的识别、分离及其干性的维持提供不同层面的实验数据,为探究LSCs niche内单细胞之间的异质性奠定基础。