相关背景及研究目的：　　 肝癌是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或肝移植是目前肝癌病人首选的治疗方法，但由于肝癌的肝内多发病灶、肝外转移及供体缺乏等因素，新诊断出的肝癌病人只有10％～15％可采取手术治疗。临床资料显示，大部分肝癌病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肝癌的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肝癌治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞（Dentritic cells，DC）为载体的肝癌疫苗目前已成为肝癌生物治疗的研究热点。　　 在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给T细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是DC在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展。目前，基于DC的肿瘤疫苗被认为是最有效的肿瘤疫苗之一，已开展大量基础研究和临床试验。DC疫苗功能的实现主要取决于两部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是负载有效的抗原，使抗原信息得以充分表达。然而，研究试验中存在许多问题，包括DC来源、制备过程、DC的抗原负载、用量、使用频度、免疫途径和次数等，因此如何解决上述问题已成为DC研究的热点。　　 专职抗原提呈细胞（profesional antigen presenting cell，pAPC）交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础，而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的“短寿蛋白”（平均半衰期约为10分钟，经蛋白酶体途径降解）；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的“长寿蛋白”（平均半衰期约为3000分钟，经自噬途径降解），两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。如何充分利用肿瘤细胞产生的全部抗原信息，诱导能更有效识别肿瘤细胞的特异性效应细胞是目前以“长寿蛋白”为基础的肿瘤疫苗所面临的难题。　　 本研究结合前期的工作基础，以Balb/c小鼠来源的肝癌细胞株-H22为靶细胞，采用蛋白酶体抑制剂阻断肿瘤短寿蛋白的降解，促使其进入自噬途径，达到募集短寿蛋白的目的，同时采用自噬诱导剂促进自噬小体形成，并采用NH4Cl抑制溶酶体功能，阻止溶酶体对自噬小体中蛋白的降解。在此基础上摹集富含肿瘤“信息”的抗原载体：富含短寿蛋白的自噬小体（Drips in blebs，简称DRibble），在前期研究中证实其比肿瘤细胞裂解液以及可溶性蛋白抗原具有更好的抗原性，能有效激发抗肿瘤应答。本研究通过对DRibble制备及其生物学特性进行初步研究，并通过静脉联合输注GM-CSF以及Flt3L，表达质粒的方法诱导小鼠DC的扩增，检测其亚型及其功能。通过制备DC/DRibble疫苗，研究其在小鼠H22皮下移植瘤中的抗肿瘤作用，为肝癌寻找新的的肿瘤生物治疗方法奠定一定的理论以及实验基础。　　 方法：　　 1.采用尾静脉注射法联合输注Flt3L和GM-CSF表达质粒，15天后收获小鼠脾脏，计算小鼠脾细胞数量；采用流式细胞术检测脾细胞CD11c、CD11b、CD8、B220等细胞表型分子以鉴定体内诱导DC的比例及亚型；　　 2.采用纳米铁以及CFSE标记的DRibble作为吞噬物，检测DC对上述物质的吞噬功能；　　 3.收获HBsAg免疫小鼠的淋巴细胞，体外以DC负载HBsAg和单独的HBsAg分别刺激并收集培养上清，ELISA法检测其IFN-γ水平；　　 4.采用蛋白酶体降解途径阻断剂、自噬促进剂、溶酶体酸化抑制剂等药物处理H22细胞，采用分步高速离心法摹集H22细胞的DRibbles；采用Western blot法检测DRibble以及裂解液中自噬小体特征性标志物-LC3-Ⅱ的水平；同时采用透射电子显微镜观察DRibble的结构与形态；　　 5.用DRibble免疫小鼠，收获小鼠的脾脏和淋巴细胞，制备效应性淋巴细胞悬液，加入DRibble、灭活的肿瘤细胞以及肿瘤细胞裂解液等刺激72小时，收集细胞上清，ELISA法检测其IFN-γ水平；　　 6.制备DC/DRibble疫苗，连续3天皮下免疫小鼠，1周后加强免疫，并采用H22细胞建立皮下移植瘤模型；通过肿瘤大小的定期测量观察DC/DRibble疫苗诱导的抗肿瘤效应。　　 结果：　　 1.尾静脉输注Flt3L和GM-CSF表达质粒小鼠的脾脏明显肿大，脾细胞总数显著增多、每脾脏达2.5～4.0×108个细胞；流式细胞仪检测发现，有20％左右的脾脏细胞为CD11c+细胞，且具有多种亚型（包括CD11c+CD11b+、CD11c+CD11b-、CD11c+CD11b-B220+、CD11c+CD11b-CD8+、CD11c+CD11b-NK1.1+等）；　　 2.吞噬实验结果显示：DC对纳米铁以及Dribble均具有较强的吞噬功能；抗原提呈实验结果显示：DC/HBsAg在体外刺激HBsAg预免疫小鼠的淋巴细胞时能够产生高水平的IFN-γ，其水平显著高于HBsAg单独刺激组，提示：体内诱导的DC具有较强的摄取、提呈抗原的能力；　　 3.H22/Dribble鉴定实验显示：经过万科、雷帕霉素及NH4Cl的处理，DRibble中检测到自噬特征性标记物-LC3-Ⅱ的表达要明显多于裂解液中LC3-Ⅱ的表达，而游离型的LC3-Ⅰ的表达却减少。提示：药物处理肿瘤细胞后，自噬活性增高，更多的游离型LC3-Ⅰ向膜结合型LC3-Ⅱ转化；透射电子显微镜观察到含双层膜结构的小体，提示有效地提取了自噬小体/DRibble；　　 4.获取DRibble免疫小鼠的淋巴细胞，体外用抗原对其进行再刺激，检测细胞培养上清IFN-γ，结果显示：DRibble刺激组产生的IFN-γ明显高于灭活的肿瘤细胞以及肿瘤细胞裂解液；　　 5.DC/DRibble疫苗以及 DRibble疫苗均能抑制H22皮下移植瘤的生长。　　 结论：　　 1.尾静脉联合输注Flt3L和GM-CSF表达质粒成功诱导了小鼠DC，体内诱导DC具有多种细胞亚群，具有较强的抗原摄取能力和抗原提呈能力；　　 2.成功从小鼠肝癌细胞-H22细胞中提取到DRibble；　　 3.DRibble作为一种新型的抗原载体，能在体外刺激效应性淋巴细胞产生高水平的IFN-γ，同时能在体内诱导较强的免疫应答并有效抑制H22肿瘤细胞的生长。