背景:中药是中华民族的瑰宝,炭药是中药中具有鲜明特色的一类药。贯众炭(DCC)是贯众高温碳化的炮制品,具有治疗衄血、吐血、崩漏、便血、外伤出血等多种出血证的功效,应用广泛、疗效确切。然而,贯众炭有效成分和质量标准研究始终未取得实质性进展。高温碳化是贯众炭炮制过程中最关键的步骤,贯众炭制备时的高温碳化法与材料学中制备纳米类成分的高温热解法工艺过程有相似之处,这就启发我们对贯众高温碳化这一过程进行研究,以期从中发现全新的纳米类成分。肝脏是机体解毒和调节糖代谢以及脂代谢平衡的主要器官,非常重要的同时也是一个容易受到伤害的器官,其损伤可能是外伤或有毒药物、化学物质和病毒感染引起。因此,寻找到能保肝且无毒副作用的天然药物是非常有意义的。本实验团队前期研究过十八种炭药,对中药炭药止血的物质基础研究具有一定的理论和实践基础。中医理论中讲究肝藏血,肝脏与血液关系密切,在贯众炭止血研究的基础上,我们借鉴了纳米科学的方法,独辟蹊径,研究了贯众炮制成炭之后产生的新成分并对其进行表征,然后研究了其对肝脏的保护作用。目的:(1)本研究以贯众炭为研究对象,通过借鉴纳米科学的技术与研究方法,对贯众炮制成炭的过程和炮制成品炭药进行研究,以期在炭药中发现新的纳米类成分。(2)对发现的纳米类成分进行细致表征,研究其微观形态、元素组成、光谱学特征,计算其荧光量子产率。(3)通过细胞实验评价贯众炭纳米类成分的安全性。(4)研究贯众炭纳米类成分对肝脏的保护作用并初步探究其发挥保肝作用的机制。方法:(1)贯众生药通过马弗炉烧制的方法炮制成炭。通过对不同温度的炮制成品贯众炭进行粉碎、提取、过滤、浓缩、透析等过程,制备贯众炭透析液。利用透射电子显微镜(TEM)、高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)、紫外-可见分光光度计(UV-vis)、傅里叶红外光谱仪(FT-IR)、荧光光谱仪(PL)等仪器和方法,在贯众炭中发现新的纳米类成分。(2)贯众炭纳米类成分的表征:借鉴纳米科学中对纳米类成分研究的技术和方法,对贯众炭中新发现的纳米类成分进行表征。利用透射电子显微镜(TEM)、高分辨透射电子显微镜(HR-TEM)表征贯众炭纳米类成分的微观结构。利用X-射线光电子能谱分析技术(XPS)研究贯众炭纳米类成分的元素组成、表面基团信息。通过紫外、红外、荧光光谱仪来表征贯众炭纳米类成分的光谱特性并计算其荧光量子产率。运用高效液相色谱法比较贯众和贯众炭纳米类成分溶液中小分子化合物的差异。(3)通过细胞实验研究贯众炭纳米类成分对细胞活力的影响,评价其安全性。(4)对贯众炭中纳米类成分的保肝作用进行研究。采用经典的小鼠肝脏出血模型和四氯化碳引起的急性肝损伤模型,研究贯众炭纳米类成分对小鼠的肝脏的保护作用及其可能机制。通过对小鼠肝脏表面形态的观察、肝脏组织病理切片的观察和肝指数的计算,初步研究贯众炭纳米类成分对CCl4引起的小鼠急性肝损伤的保护作用。贯众炭纳米类成分的保肝作用机制的研究:分析小鼠肝脏的病理特征,检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、甘油三酯(TG)的变化情况,测定小鼠肝脏匀浆中脂质过氧化的度量丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量,初步研究纳米类类成分的保肝作用机制,明确贯众炭发挥保肝作用的物质基础。结果:(1)通过对贯众炮制最核心的高温加热碳化过程研究,成功炮制了不同温度的贯众炭。经过粉碎、提取、过滤、浓缩、透析等一系列制备过程处理后,利用透射电子显微镜观察贯众炭透析液里的微观成分。350℃炮制的贯众炭中有着清晰的碳颗粒,分散性良好、均一稳定,粒径尺寸范围在5-10 nm之间,符合碳纳米类成分的特征。将新发现的纳米类成分命名为贯众炭纳米类成分(DCC-NCs)。(2)贯众炭纳米类成分的表征:TEM和HR-TEM结果显示出贯众炭中含有纳米类成分,粒径分布在1~7 nm之间,符合纳米类成分的粒径分布特征,晶格排列整齐,间距为0.278 nm。XPS分析表明贯众炭纳米类成分中含有C、O、N等元素,其中碳元素占主导地位,经过XPS分峰并结合红外光谱可发现DCC-NCs表面官能团丰富,这些官能团可能就是影响其化学性质的关键所在。DCC-NCs的紫外光谱结果表明其中有共轭结构存在,有可能是-C=O羰基引起的n-π*跃迁。荧光光谱显示其最大激发波长在360 nm,最大发射波长在460 nm,两个图谱镜面对称性好。HPLC比较了绵马贯众药材和DCC-NCs的化学成分差异,研究结果表明贯众中含有的大量小分子成分,经过炮制、过滤、透析等过程后已完全除去。(3)贯众炭纳米类成分保肝作用的研究:通过对小鼠肝脏出血模型的给药研究,研究结果表明DCC-NCs具有抑制小鼠肝脏出血的作用,对四氯化碳引起的小鼠急性肝损伤模型,DCC-NCs能减少细胞坏死和细胞核碎裂,缓解肝脏肿胀,显示出了良好的保肝效果。(4)DCC-NCs能降低CCl4引起的急性肝损伤小鼠的ALT和AST,对TBA和TBIL的升高有缓解作用,能显著降低MDA同时提高SOD水平,表明DCC-NCs能提高机体清除氧自由基的能力,抑制自由基脂质过氧化反应,阻止肝细胞脂质过氧化,从而避免肝细胞的损伤,这可能就是DCC-NCs发挥保肝作用的机制。结论本实验通过一系列制备条件研究、微观结构观察,光谱特性考察,成功在炮制后的贯众炭中发现了类似碳点的纳米类成分(Nano-components),并命名为贯众炭纳米类成分(DCC-NCs),其最佳炮制温度为350℃,贯众炭纳米类成分(DCC-NCs)均一稳定,符合纳米类成分的微观结构特征以及光学特性,表面活性基团种类丰富、光化学稳定性好。HPLC法证明所分离得到的DCC-NCs中不存在贯众中原有的小分子类成分。通过详细表征进一步证明从贯众炭中所分离的成分为纳米类成分。通过小鼠肝脏出血模型和四氯化碳引起的急性肝损伤模型验证了DCC-NCs对肝脏的保护作用,保肝效果良好。通过对DCC-NCs作用后小鼠血清中转氨酶的变化情况,总胆汁酸、总胆红素的变化情况和超氧化物歧化酶、丙二醛的变化情况综合分析,DCC-NCs对肝脏损伤的保护机制可能是提高机体清除氧自由基的能力,阻止肝细胞脂质过氧化同时调节胆汁酸和胆红素的代谢,从而预防和改善肝细胞的损伤情况。总之,DCC-NCs具有很好的降酶保肝作用。可能成为一种绿色、安全且方便的肝损伤疾病治疗药物。