极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A cidithiobacillus ferrooxidans,简称At.f是一类典型的专性化能自养细菌,能够从亚铁离子(Fe2+)、元素硫(S0)及其它还原性硫化合物(RISCs)的氧化过程中获得能量,通过固定空气中的CO2获得碳源进行生长,是目前硫化矿生物冶金应用中的优势高效浸矿菌种,同时也是研究浸矿微生物铁、硫氧化代谢机制的模式菌。在生物冶金中,At.f除了必需具备高效的亚铁氧化能力之外,还需要具有高效的硫氧化能力,才能有效降解硫化矿表面和氧化分解中不断积聚形成的硫层(S0),提高浸出效率。但是相对只有两个价态的铁氧化,具有从-2到+6多个价态硫的氧化代谢错综复杂,目前关于At.f的硫氧化代谢机制研究主要是基于生物信息学和转录组学推测建立的模型,尤其是元素硫的氧化——这一整个硫氧化代谢的关键点在At.f中至今还没有明确的定论。硫加双氧酶(SDO)作为嗜酸性氧化亚铁硫杆菌中单质硫氧化的关键酶,一直是国内外相关领域科学家研究的热点,但是它的编码基因却一直没有在At.f中找到。通过同源序列比对和活性检测,我们首次发现AFE0269就是硫加双氧酶的编码基因,进而开展了对At.f的硫加双氧酶的一系列研究。首先,我们克隆At.f中sdo基因,构建了异源表达载体pET-22b(+)-sdo,在大肠杆菌中高效表达并纯化了At.f的硫加双氧酶,对纯酶进行了酶学性质检测,研究表明：第一,SDO的最适作用温度是35℃左右,在4℃-45℃之间均有酶活,50℃以上酶活力丧失。第二,当GSH=0.8mM时最适pH值大约在7.6,在pH值<6时,酶活为零。第三,除了Mg2+对此酶表现中等程度抑制以外,其余常见二价金属离子都强烈抑制SDO的酶活性；二硫键还原剂DTT稍提高了SDO的酶活：NEM巯基修饰剂强烈抑制SDO的酶活性。我们进一步研究了At.fATCC23270分别以Fe2+和硫粉为能源时,其硫代谢几个关键酶基因的表达情况,结果发现以Fe2+培养的菌体中(相对于S0) sdo基因的表达上调了4倍,同时doxD-1基因上调了4.5倍,推测sdo是组成型表达,而且At.f的硫氧化系统和铁氧化系统之间存在重要关联。我们构建了sdo在At.f中过表达工程菌At.f (pJRD215-psdo),研究了sdo基因的过表达对工程菌的硫代谢以及硫氧化相关其它关键酶基因表达的影响。结果显示工程菌中的sdo基因比对照菌At.f(pJRD215))上调了80倍,说明质粒上的sdo基因利用自身启动子在At.f中获得高效表达；此外,硫代硫酸盐醌氧化还原酶的编码基因doxD-1基因上调了400倍左右,因此我们认为sdo基因和doxD-1基因之间有十分密切的联系,两个基因都在At.f元素硫代谢中起重要作用。然而,通过对工程菌生长曲线和硫氧化能力的检测,发现sdo基因过表达工程菌仅比对照菌表现出微弱的生长和硫氧化优势。为了明确SDO在At.f中的功能,我们将它的编码基因AFE0269进行了敲除,首先成功构建了自杀质粒pKIT-Ksdo,通过接合转移转入At.f中,依赖抗生素的选择压力成功获得了发生第一次同源重组的单交换子,接着通过导入诱导质粒pJRD215-I-SceI,诱发单交换子发生第二次同源重组产生双交换子,通过检测证明初步获得了sdo基因敲除的双交换子。但是双交换子中仍杂有部分单交换子,目前正在分离纯化,相信很快能获得纯的sdo突变株,再对突变株的性能进行研究。我们对极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌硫加双氧酶的研究一方面丰富了SDO蛋白的酶学信息,为At.f硫氧化模型的完善提供可靠的实验数据,具有一定的理论价值：另一方面为进一步构建硫氧化能力提高的浸矿工程菌提供了借鉴。