电压依赖、钙离子敏感的大电导钾离子通道(Maxi-K or BK)参与调控多种生理过程,如平滑肌收缩、神经递质分泌以及听觉的形成等。BK通道由α亚基以及多个辅助亚基((β、γ)构成,这些辅助亚基的调节作用极大的丰富了 BK通道的多样性,是BK通道在多种组织中行使不同功能的基础。因此,关于BK通道β辅助亚基的结构与调节机制的研究具有十分重要的意义。本文以BK通道hβ4、hβ1亚基为研究对象,以HEK293细胞、大肠杆菌为工具,利用原核表达技术、蛋白纯化技术,结合质粒构建、突变等分子生物学方法与膜片钳等电生理学方法,探索了 hβ1与α亚基的结合位点,尝试了 hβ4以及hβ2亚基的胞外环区重组蛋白的表达纯化结晶以及原核表达TrpV1通道激活多肽——蜘蛛毒素spiToxin1。本文同时对Nav1.5通道的慢失活及慢恢复过程进行了探索。主要内容如下:(1)通过类比于已发现的hβ2与α亚基相互结合的位点,在hβ1、hβ3、hβ4上搜索相应同源位点,我们发现突变体hβ1(E13,T14)能改变BK通道电流的电压依赖性,并且与mSlo1(K392,R393)结合在一起。根据同源建模及疏水性分析,本文还鉴定出hβ1(Y105)与mSlo1(S202)之间的相互作用。通过疏水性分析及构建一系列的hβ1突变体,我们发现hβ1N端(L5,V6,M7)与mSlo1可能通过疏水作用相互结合。(2)通过在原核体系中融合不同蛋白分子标签,我们发现hβ4的胞外环区(hβ4loop)可形成可溶性的表达。本文在经过NI亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等一系列生化手段纯化后,得到了一定量的、状态均一、稳定性良好、纯度较高的hβ4loop重组蛋白,并在结晶实验中发现了的片状微晶。同时本文还探索了hβ2loop蛋白的原核表达及变性复性条件的优化。(3)应用原核体系得到了重组的蝎毒素IBTX以及蜘蛛毒素spiToxin1等动物毒素,通过电生理鉴定发现重组的IBTX能够特异性的阻断BK,重组SpiToxin1能够有效激活TrpV1通道。此项工作为利用天然毒素进行多肽药物设计与表达、研究β亚基对通道毒素敏感性影响奠定了基础。(4)本文还研究了 Nav1.5通道的慢失活及慢恢复过程,为建立更精确的Nav1.5模型提供详细的电生理数据。