第一章PLMBMG多孔复合生物活性材料的制备及理化性质检测目的：制备骨基质明胶（BMG），采用超临界二氧化碳法与聚乳酸（PLA）复合制备PLA／BMG多孔复合生物活性骨植入材料，通过理化性能检测选择PLA／BMG最佳复合比例，为后续实验研究提供依据。方法：选取合格供体皮质骨，按山西省医用组织库同种骨生产标准进行冷冻、清洗，粉碎后选择粒径大小为50μm～200μm的骨粉，将其进行脱脂、脱钙等处理制备成骨基质明胶（BMG）；将PLA与BMG按体积比10：0、9：1、8：2，7：3，6：4进行混匀，再加入粒径为100μm～200μm的NaCl颗粒作为造孔剂（与复合材料的质量比为3：1），置于超临界二氧化碳反应装置内，将其密封后用液泵将冷凝到0℃以下的CO₂压进反应釜内，当反应釜内压力达到20MPa时，开始升温，使反应釜内温度达到36℃，调节釜内的压力和温度，保持温度变化不超过士0.5℃，压力变化为±0.1MPa。经过30 min后，以5 MPa／min的速率放气，打开反应釜，取出样品，去离子水浸沥NaCl 48h，冷冻干燥，包装后进行辐照灭菌备用。通过大体观察、孔隙率测定，力学检测、SEM观察评价其理化性能，并结合体外细胞相容性检测选择最佳复合比例。结果：所制备PLA／BMG复合材料大体观察结构疏松，有较好的孔隙率，类似人体松质骨样结构；不同比例复合材料孔隙率均大于60％，且随着BMG含量的增加而增大；PLA／BMG复合材料的抗压强度及弹性模量均随BMG含量的增加而逐渐降低，当BMG含量大于30％时，力学性能下降显著；细胞相容性方面，聚乳酸材料明显的抑制了大鼠L6成肌细胞的增殖，但随着BMG比例的增大，细胞相容性逐渐转好，达到40％时，基本与正常培养基组相同，对细胞增殖无明显影响。扫描电镜观察所制备含30％BMG的复合材料BMG与PLA混合均匀，BMG与PLA结合较为致密，材料孔隙分布均匀，孔隙大小大约在200μm-400μm之间，孔洞连通性好，且在孔隙内壁上，仍可见大量孔径为10μm左右的小孔隙。结论：采用SC-CO₂法制备的PLA／BMG多孔复合支架材料中BMG的比例与材料的孔隙率及细胞相容性成正相关，与力学性能成负相关；含30％BMG的复合材料具有良好的综合性能，为SC-CO₂法制备PLA／BMG的最佳复合比例。第二章PLA／BMG多孔复合材料生物相容性检测目的：采用动物体内实验和细胞体外实验评价所制备PLA／BMG多孔复合生物活性材料的组织生相容及细胞相容性，为PLA／BMG复合材料提供生物相容性实验数据。方法：体外细胞毒性评价：参照中华人民共和国医疗器械生物学评价标准，将所制备的PLA／BMG复合材料、PLA材料按质量与浸提液0.1g／ml的比例，浸入不含血清的DMEM高糖培养基的封闭容器内，37℃培养箱72h，取出材料，将浸提液离心，取上清液并加入10％的胎牛血清；将对数生长期的小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞制备为1.5×10⁵／ml细胞悬液，并接种于96孔培养板，单纯DMEM高糖培养液组作阴性对照，不含细胞孔作为空白对照，每孔200μl，培养24h待细胞贴壁后，按组别分别加入200μl材料浸提液，置37℃5％CO₂培养箱中继续培养，每2d更换浸提液一次。分别于培养1、2、3、4、5、6、7d后，每孔加入30μl 2mg／ml的MTT溶液，继续培养4h，吸出孔内培养液后，每孔加入150μl DMSO，振荡使结晶物溶解，酶标仪检测各孔OD值，测试波长为570 nm，计算细胞增殖率并转换为细胞毒性级。PLA／BMG复合材料细胞亲和性测定：将PLA／BMG修剪成3mm×3mm×3mm大小，放置于6孔培养板；传代至第3代的MC3T3-E1细胞以1×10⁴／ml接种于已放置材料的培养板，加DMEM高糖培养基至完全淹没材料，于接种后1、3、5天倒置相差显微镜观察细胞生长及与材料贴附情况，并于第5天取出材料，扫描电镜观察细胞贴附情况。生物相容性体内评价：Wistar大鼠20只，无菌条件下，分别将PLA及PLA／BMG植于脊柱左、右侧的皮下，及左右后肢的股肌袋内，术后行大体观察术后饮食、活动、切口反应等，于术后2、4、6、8周随机处死5只动物，切取包括植入材料及周围组织的复合组织块，常规组织切片，HE染色，光镜下观察材料及周围组织的组织学变化。结果：体外细胞毒性检测：PLA／BMG复合材料浸提液培养细胞1～7天内细胞增殖率均大于100％，细胞毒性级均为0级；而PLA材料组第2、4、7天细胞增殖率小于100％，细胞毒性级为1级。材料与细胞复合培养第1天，材料周围基本无细胞贴附，至第3天，材料侧缘可见少量细胞贴附，材料周围细胞形态正常，第5天，材料侧缘贴附细胞增多，周围细胞生长状态良好，部分部位呈汇聚状态；扫描电镜观察可见，材料表面及材料孔隙内壁均有细胞贴附，细胞呈三角形或多边形，表面有较多的突起。有些部位多个细胞在材料表面汇合成片状分布，细胞与材料贴附紧密，细胞表面有泡状突起，且可见分裂相细胞。皮下及肌内植入实验显示PLA组材料被纤维结缔组织所包裹，周围组织及材料内部结缔组织内含有较多的淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞，结缔组织向材料内部生长缓慢；PLA／BMG组纤维组织包裹不明显，结缔组织易于向材料中心长入，材料周围组织及材料内部长入的结缔组织内炎症细胞少见，可观察到间充质细胞向材料中散在的BMG贴附。结论：SC-CO₂法制备的PLA／BMG复合材料对MC3T3-E1细胞有较好的细胞亲和性，细胞毒性级别为0级，具有良好的细胞相容性；皮下及肌内植入均显示PLA／BMG复合材料较单纯PLA材料具有更好的组织相容性。第三章PLA／BMG多孔复合材料生物活性检测目的：体外将PLA／BMO复合材料与小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞共培养，通过对钙结节、钙含量与ALP活性的测定，间接评价PLA／BMG多孔复合材料的骨诱导活性，为进一步实验提供实验依据。方法：实验分组：DMEM组为培养基对照组（不含任何材料）；PLA／BMG组为每孔加入100μg粉碎的PLA／BMG复合材料；PLA组为每孔加入100μg粉碎的PLA；每组设6复孔。将小鼠MC3T3-E1成骨前体细胞适当传代后，稀释制成2×10⁶／ml细胞悬浮液，每孔20μl接种于含不同组别材料的24孔培养板内，细胞粘壁后，分别加入1ml含10μmol／mlβ-甘油磷酸及5μg／ml抗坏血酸的DMEM高糖培养基。每3d换液一次，每次换液量为培养液的2／3，培养2周后，消化收集细胞。钙结节测定：PBS沖洗收集细胞后的培养板，福尔马林溶液固定后，1％茜素红溶液染色，倒置相差显微镜观察，数码相机拍摄每个培养孔图像，图像处理与分析软件测定被染色面积占培养孔总面积的百分比，即为钙化结节面积百分比。钙含量及碱性磷酸酶（ALP）活性测定：0.2％的NP-40重新悬浮收集细胞，在冰浴中超声裂解，将细胞裂解液严格按照钙含量及ALP活性测定试剂盒说明书进行钙含量及ALP活性的检测。应用方差分析和Tamhane’s T2检验进行统计学分析。结果：PLMBMG组ALP活性、钙含量及钙化面积均值分别为[（325.594±70.40）U／g prot、（3.51±1.64）mmol／g prot)、（42.98±4.44）％]均高于PLA组[（63.624±30.01）U／gprot、（1.04±0.21）mmol／g prot、（9.55±1.94）％]（P＜0.05）及DMEM培养基组[（2.40±1.47）U／g prot、（0.70+0.24）mmol／g prot、（0.86±0.41）％]（P＜0.05），同时PLA组的ALP活性及钙化结节面积与DMEM培养基组也存在显著差异（P＜0.05）。结论：采用SC-CO₂法制备的PLMBMG多孔复合支架材料具有良好的骨诱导活性，好于单纯PLA材料，有可能作为一种有前景的骨植入材料及骨组织工程支架材料。第四章PLA／BMG多孔复合材料修复兔桡骨节段性骨缺损的实验研究目的：建立兔桡骨节段性骨缺损模型并将PLA／BMG多孔复合材料植入，评价其修复节段性骨缺损的能力，为可能的临床应用提供实验依据。方法：选用新西兰大白兔24只，腹腔麻醉后，无菌操作暴露桡骨中段，牙科钻截取兔双侧桡骨中段，造成约12mm骨缺损，按组别分别植入各组材料，于术后4w、8w、12w分别取材，每次8只。实验分组：空白对照组，骨缺损处不植入任何材料作为阴性对照；PLA材料组，骨缺损处植入PLA材料；PLA／BMG复合材料组，骨缺损处植入PLA／BMG多孔复合材料；自体骨组，骨缺损处将截取的自体骨再植入骨缺损处，作为阳性对照。X光检查：动物于取材时间，行桡骨正位X线片检查，观察不同时间点骨缺损愈合情况。根据Lane等的X线片评分标准对各组移植区骨形成、骨连接和骨塑形情况进行评分，并进行统计学检验。组织学观察：截取桡骨植骨部位，有机树脂包埋，用硬组织切片机制作厚度为5μm切片标本，进行HE染色，光镜下观察骨形成及材料降解情况。结果：大体观察：除空白对照组1例，PLA组2例出现骨折外，其余动物术后状态良好，术肢无明显并发症发生。X线观察：空白对照组术后4w骨缺损两侧骨断端锐利，没有任何骨痂形成，骨缺损区明显可见；术后8w，骨缺损两端可见少量低密度骨痂形成，骨缺损区缩小；术后12w，缺损区仍空虚，两骨断端细长骨痂形成，骨缺损区进一步缩小，未见连续性骨痂，骨髓腔封闭，为骨不连。PLA组术后4w骨缺损两端有少量低密度的骨痂形成，缺损区呈现密度低于骨干的雾状影；术后8w，两断端在近尺骨侧出现高密度骨痂连接，远离尺骨侧骨缺损仍清晰可见；术后12w，骨缺损两端基本连接，骨密度不均，周围有骨痂形成，骨髓腔没有再通。PLA／BMG组术4周两断端有骨痂包裹，缺损区呈现大片云雾状高密度影，骨缺损区不易辨认；术后8w，骨缺损两端均基本连接，缺损区内呈现高密度影；术后12w，新骨桥接骨缺损，密度较均一，皮质骨连续，形成连接性骨质，骨缺损基本完全愈合，髓腔再通。自体骨组术后4w骨缺损区自体骨仍清晰可见，截骨端有少量骨痂形成；术后8w，植入自体骨段与宿主骨两端连接，连接处呈现高密度影，有较多的骨痂形成；术后12w，新骨桥接骨缺损，密度较8周时增高，但不均匀，周围有大量骨痂形成，髓腔再通。X线评分：术后4w、8w、12w，PLA／BMG复合材料组（4.25、7.25、9.50）与自体骨组（4.50、8.00、10.25）在修复骨缺损上无显著性差异，而PLA／BMG组和自体骨组修复骨缺损效果优于空白对照组（0.25、0.50、1.25）和PLA组（1.00、3.50、4.25），存在显著性差异（P＜0.05）；PLA组仅在第8w显示出修复效果好于空白对照组（P＜0.05），而4w与12w两组间无显著性差异。组织学观察：空白对照组骨缺损被纤维组织填充，无新骨组织形成。PLA组材料逐渐被纤维组织包裹吸收，成骨不活跃；PLA／BMG组材料可见大量新生骨向材料内部长入，间充质细胞向BMG贴附，材料与宿主骨结合紧密；自体骨组材料结合部有大量骨痂形成，骨组织已进行改建与重塑。结论：PLA／BMG多孔复合材料与自体骨具有相同的修复节段性骨缺损能力，优于PLA材料的修复能力。