用再生医学的理念构建生物心脏起搏器给病窦综合征等严重缓慢型心律失常的治疗带来了新希望。目前，构建生物心脏起搏器的方法主要有：基因转染、细胞移植和组织工程体外构建等。基因转染的安全性及长期有效性有待解决，而细胞移植和组织工程方法均需要种子细胞-起搏样细胞，所以寻找合适的种子细胞已成为构建生物心脏起搏器的关键。目前，起搏细胞的来源包括：（1）成体细胞，如窦房结细胞，幼稚心脏细胞及转基因的心肌细胞；（2）各类干细胞，可在体外或体内诱导成为起搏细胞，如胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）、诱导性多能干细胞（induced pluripotentstem cells, iPS）和成体干细胞（adult stem cell）等。其中，成体干细胞具有广阔的临床应用前景，而其他细胞则存在细胞来源、免疫排斥、成肿瘤或伦理安全等问题。近年来的研究表明，脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells, ASCs）和去分化脂肪细胞(dedifferentiated fat cells, DFAT)在体外能够被诱导甚至自发分化为跳动的心肌细胞，然而，也有部分研究认为ASCs不能被诱导分化为心肌细胞。分析这些研究，我们认为诱导分化成功的关键除了培养分化条件外，还可能与脂肪组织的取材部位有关，不同部位脂肪组织的差异可能导致了诱导分化结果的不一致。更重要的是，分化后跳动的心肌细胞是否是起搏细胞或是否具有起搏细胞的特征尚未得到证实。本研究旨在明确脂肪组织常用取材部位肩胛间和腹股沟区脂肪组织的差异，以及其来源的干细胞向心肌细胞分化的能力，并验证这种分化后细胞的起搏特征，为进一步构建生物心脏起搏器奠定基础。第一部分肩胛间和腹股沟皮下脂肪组织的特征及差异研究目的：研究小鼠肩胛间和腹股沟皮下脂肪组织的特征及差异。材料和方法：分别取小鼠肩胛间脂肪和腹股沟皮下脂肪，大体形态观察两种组织差别，组织切片HE染色观察组织细胞构成差异，透射电镜观察脂肪细胞超微结构。提取组织RNA，分析两种脂肪组织基因表达。结果：大体形态观察表明，小鼠肩胛间脂肪呈棕褐色，而腹股沟皮下脂肪外观为亮白色。HE染色发现，肩胛间脂肪含量大量棕色脂肪细胞，少量白色脂肪细胞混杂其中；腹股沟处皮下脂肪大部分为白色脂肪细胞，但淋巴结周围有棕色脂肪细胞存在。棕色脂肪细胞小而含分散脂滴，白色脂肪细胞大，含单房脂滴。透射电镜超微结构观察，棕色脂肪细胞内线粒体大而丰富，而白色脂肪细胞线粒体小且少。基因表达分析，脂肪和心肌相关基因分别表达与脂肪组织和心肌组织中，个别心脏发育早期基因表达于脂肪组织中。结论：肩胛间部位脂肪组织主要为棕色脂肪，其中仅有少量白色脂肪；而腹股沟皮下脂肪组织主要为白色脂肪，在淋巴结周围有棕色脂肪细胞分布。两种脂肪细胞有明显的形态学差异。第二部分棕色脂肪组织来源的干细胞向心肌细胞的定向分化研究目的：研究并比较来自白色和棕色脂肪的干细胞体外向心肌细胞分化的能力。材料和方法：分别取腹股沟皮下白色脂肪和肩胛间棕色脂肪组织经胶原酶消化离心后，取下层间充质干细胞在20%FBS中常规培养，取上层漂浮的成熟脂肪细胞经天花板培养待贴壁或去分化后在20%FBS中常规培养，免疫细胞化学方法及基因表达鉴定心肌细胞的标志物。结果：棕色脂肪来源的ASCs培养1周即可见有自发搏动的肌管状细胞或小圆形细胞，自发搏动频率大约130次/分钟，表达α-actinin、troponin T/troponinI和Cx40等。而白色ASCs培养后呈现成纤维细胞样改变，α-actinin为阴性，少量细胞Troponin T/Troponin I和Cx40弱阳性。棕色DFAT培养后3周后形成有肌管状细胞并逐渐成片搏动，培养2周时即表达超极化激活环核苷酸门控通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels, HCN）2、4和缝隙连接蛋白Cx45。而白色DFAT未见分化为肌管状细胞，培养2周时HCN2、HCN4和Cx45表达呈弱阳性。结论：来自棕色脂肪的ASCs和DFAT细胞在体外可以定向分化为自发搏动的心肌细胞，而来自白色脂肪的ASCs和DFAT细胞则不能。第三部分自发搏动心肌细胞的起搏细胞特征鉴定研究目的：研究来自棕色脂肪的干细胞分化的自发搏动的心肌细胞是否具有起搏细胞的特征。材料和方法：通过免疫细胞化学鉴定细胞起搏特征离子通道蛋白HCN4的表达，细胞内钙成像检测钙瞬变，细胞膜片钳检测细胞的动作电位，药理学检测其心肌细胞的功能，透射电镜观察细胞的超微结构。结果：棕色脂肪来源的ASCs和DFAT分化的自发搏动的心肌细胞均高表达HCN4。ASCs有自发钙瞬变现象，并可记录到其自发的动作电位。异丙肾上腺素（isoproterenol, ISO）或去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）可使搏动心肌细胞的搏动加快，而乙酰胆碱（acetylcholine, Ach）或心得安（propranolol, Pro）则使得搏动频率下降。透射电镜可见，棕色ASCs和DFAT分化的自发搏动的心肌细胞均有不规则的肌丝。结论：来自棕色脂肪的干细胞分化成的自发搏动心肌细胞具有起搏细胞特征。