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炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种特发性肠道炎症性疾病,病变范围累及回肠、回盲部、结肠以及直肠。临床常表现为腹泻、腹痛、甚至血便,部分患者可有肠梗阻的症状。本病主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(crohn’s disease,CD)。UC 是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症,疾病通常先累及直肠,逐渐向全结肠蔓延。CD可累及全消化道,为非连续性全层炎症,最常累及部位为末端回肠及回盲部,部分累及结肠和肛周。肠道纤维化是IBD的并发症,也是肠腔狭窄导致的肠梗阻和手术的主要原因,主要病理特点为以胶原为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肠道组织的过度合成以及异常沉积,病程不可逆转。延缓肠道纤维化可改善IBD的自然病程,降低手术率。作为肠道纤维化的主要效应细胞,肠道成纤维细胞在炎症初期的出现是损伤愈合的表现,但肠道纤维母细胞的过度增殖与活化,向肌成纤维细胞的转化以及分泌大量以胶原为主的ECM和细胞因子,在肠道纤维化过程中同样扮演了关键的角色。近来,越来越多的研究证实内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在一些组织或者细胞的分化以及凋亡中起到重要的作用,且持续的ERS和多种器官组织如肝脏、肺、肾以及血管的纤维化有关,是这些器官组织纤维化的机制之一。但是肠道组织是否存在ERS,以及ERS在肠道纤维母细胞中的作用,目前鲜有文献报道。依据先前的研究基础,我们推测,IBD的肠道纤维化中,肌纤维母细胞的ERS在组织纤维化过程中起到重要作用。因此,本研究通过建立三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠 IBD纤维化模型以及体外采用衣霉素(tunicamycin,TM)诱导小鼠结肠纤维母细胞ERS的方法,在体内以及体外观察小鼠结肠纤维化组织以及纤维母细胞ERS标志性蛋白,探讨肠肌纤维母细胞ERS在炎症性肠病肠道纤维化及细胞重塑过程的作用。具体内容概括如下:第一部分ERS相关蛋白在TNBS诱导的小鼠IBD肠纤维化模型中的动态变化研究目的:ERS相关蛋白在TNBS诱导的小鼠IBD肠纤维化模型中的动态变化,探讨ERS在小鼠UC肠纤维化中的作用。研究方法:雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为正常组(control组,C组),TNBS组(T组),TNBS+TUDCA组(TT组)。C组给予生理盐水灌肠作为对照,T组给予TNBS每周灌肠1次造模,TT组在TNBS灌肠的基础上,给予ERS保护剂牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)饲喂。三组动物均分别于造模后的第1周,第2周以及第4周随机处死,并取结肠组织进行病理切片和蛋白提取处理。采用苏木精-伊红染色(HE染色)、马松(Masson)三联染色、免疫组化技术以及Western blot法观察结肠组织的病理染色形态以及ERS相关蛋白的表达。研究结果:相比于其他两组,TNBS组的纤维化更为明显,表现为肠黏膜下层纤维母细胞大量聚集,后期(灌肠四周后)胶原过度沉积,肠壁结构发生重塑。同时,ERS现象明显。在加入ERS调节剂TUDCA后,ERS现象减轻,同时伴有纤维化的明显缓解。研究结论:TNBS可以成功诱导小鼠结肠的纤维化,同时纤维化的过程有ERS的参与。通过调节ERS,可以显著改善纤维化进程。第二部分ERS对小鼠结肠纤维母细胞表型变化的调节以及TUDCA对纤维细胞母ERS影响的体外研究研究目的:建立TM诱导的小鼠结肠纤维母细胞ERS体外模型,并在此基础研究TUDCA在细胞层面上对内质网应激的调控作用。研究方法:本部分实验分两个部分。第一部分是提取原代小鼠结肠肌纤维母细胞,6周龄C57BL/6小鼠结肠采用组织块贴壁法分离获取纤维母细胞,并采用差速贴壁法进行细胞的提纯。第二部分是细胞模型的建立,将提取的纤维母细胞随机分为4组,分别为正常组(control组,C组)、TM组、TUDCA组、TM+TUDCA组,并通过CCK-8细胞毒力试验确定最适给药浓度。采用RT-PCR技术检测细胞中GRP78,CHOP以及α-SMA mRNA的表达变化,Western blot检测相应蛋白的表达情况。研究结果:TM可导致结肠肌纤维母细胞ERS,发生ERS的纤维母细胞α-SMA的表达量明显升高,提示细胞发生重塑,纤维母细胞转化为肌成纤维细胞。ERS调节剂TUDCA可缓解ERS,并显著改善纤维母细胞向肌成纤维细胞的转化。研究结论:ERS导致纤维母细胞向肌成纤维细胞转化是纤维化的重要机制,且调节ERS可以显著改善这一进程。