论文部分内容阅读
钙激活氯离子通道（calcium-activated chloride channels,CaCCs）是一类在哺乳动物细胞中广泛表达的阴离子通道,在上皮液体转运、肠动力调控、平滑肌收缩、神经元兴奋和伤害感受等多种生理调节过程中发挥至关重要的作用。大量的研究显示CaCCs功能与慢性便秘、高血压、先天性巨结肠、肿瘤及腹泻等多种疾病密切相关。长期以来,虽然功能性研究提示存在多种类型的CaCCs,但是除了 2008年得到克隆的TMEM16A（也称ANO1）外,其它类型的CaCCs的分子身份尚未得到确认。发现新类型的CaCCs不但对于揭示其确切的生理病理作用具有重要的理论意义,还能为多种疾病的药物治疗提供新的靶标。CaCCs特异性的调节剂是目前研究其多种病理生理功能的关键工具,选择性调节剂不但能够在细胞和离体组织模型上区别分析已知和未知CaCCs氯离子通道的活性,而且能够为CaCCs氯离子通道的生理功能和病理生理机制研究提供有效的分子探针。现有的几种TMEM16A和肠道上皮一种分子身份未知的CaCC（上皮型CaCC,CaCCGI）氯离子通道选择性调节剂均是从组合化学小分子库中筛选得到的,这些调节剂在明确CaCCs的生理功能方面发挥了巨大的作用。发现高亲和力、选择性强、适合离体组织和体内活性研究的CaCCs小分子调节剂仍然是相关领域研究的重点内容。本研究的目标是从天然化合物中筛选能够在肠腔侧抑制TMEM16A和CaCCs氯离子通道从而抑制肠道液体分泌与肠动力的天然小分子抑制剂。本研究中,我们利用稳定共转染对卤族元素敏感的绿色荧光蛋白YFP（YFP-H148Q/I152L）和人 TMEM16A 的 FRT 细胞系（FRT-TMEM16A-YFP-H148Q/I152L）作为TMEM16A氯离子通道功能测定模型,从天然小分子中筛选具有TMEM16A氯离子通道抑制活性的化合物。利用稳定转染YFP（YFP-H148Q/I152L）和人 CFTR 的 FRT 细胞系（FRT-CFTR-YFP-H148Q/I152L）和表达内源性CFTR与CaCCGI氯离子通道的人结肠癌HT-29细胞对上述活性化合物的选择性进行分析;利用荧光测定模型和短路电流测定方法对上述抑制剂的基本分子药理学特性进行分析;进一步利用离体小鼠结肠粘膜短路电流实验、小鼠肠蠕动实验和新生小鼠轮状病毒感染模型对TMEM16A氯离子通道抑制剂的体内活性进行分析。实验结果:1.筛选得到两种木脂素类化合物（kobusin和松树酯醇二甲醚eudesmin）,以及一种萘醌类化合物（左旋紫草素shikonin）对TMEM16A氯离子通道具有抑制作用,IC50值分别约为20μM（kobusin）、50μM（松树酯醇二甲醚）与6.5μM（左旋紫草素）。2.在转染的细胞上进行的短路电流分析显示kobusin、松树酯醇二甲醚和左旋紫草素顶膜侧给药能够剂量依赖地抑制TMEM16A介导的Cl-电流,IC50值分别为100 μM（kobusin）、200μM（松树酯醇二甲醚）和1 μM（左旋紫草素）;基底膜给药kobusin、松树酯醇二甲醚和左旋紫草素对TMEM16A氯离子通道没有抑制作用。3.Kobusin与松树酯醇二甲醚对人结肠癌HT-29细胞CaCCGI氯离子通道介导的C1-电流具有激活作用,且该活性与ATP对CaCCGI的激活存在协同作用。左旋紫草素对HT-29细胞CaCCGI氯离子通道具有抑制作用,IC50值约为17.5μM;对ATP激起的瞬时电流与持续电流具有阻断作用,说明HT-29细胞ATP激活的电流是由不用的CaCCs氯离子通道介导的;左旋紫草素不影响HT-29细胞内Ca2+浓度。由于kobusin与松树酯醇二甲醚对TMEM16A和CaCCGI的作用是相反的,说明上述两种氯离子通道具有不同的分子属性。4.功能测定研究结果显示kobusin与松树酯醇二甲醚对CFTR氯离子通道具有激活作用,EC50值分别为30μM与50μM;且该活性具有FSK依赖的特点,与IBMX具有相加作用,与Gen具有协同作用;Kobusin与松树酯醇二甲醚对CFTR氯离子通道的激活作用具有快速可逆的特点,激活作用在4min时达到最大激活,洗脱后15 min激活作用完全消失。利用HT-29细胞进行的短路电流测定结果进一步证实了 kobusin与松树酯醇二甲醚激活CFTR氯离子通道表现出FSK依赖。5.离体组织短路电流实验结果显示kobusin与松树酯醇二甲醚能够在粘膜侧激活小鼠结肠粘膜上皮CFTR与CaCCGI介导的Cl-电流,且该激活作用能够被选择性抑制剂CFTRinh-172（CFTR）和CaCCinh-A01（CaCC）完全抑制;左旋紫草素在粘膜侧能够显著抑制卡巴胆碱激起的短路电流,最大抑制率达到48%,P<0.01,抑制效率优于已知的CaCCGI氯离子通道抑制剂CaCCinh-A01（34%,p<0.05）;左旋紫草素在粘膜侧或浆膜侧对小鼠结肠粘膜上皮CFTR氯离子通道均无抑制作用,对小鼠结肠粘膜浆膜侧的Na+/K+-ATPase也没有抑制作用。6.体内活性研究显示kobusin、松树脂醇二甲醚和左旋紫草素口服给药能够显著降低小鼠肠蠕动（p<0.01）;在病毒感染前一天与病毒感染当天开始口服给药两种给药方式下,左旋紫草素均能显著减少轮状病毒感染的新生小鼠粪便含水量,且不影响病毒的感染过程,最大有效作用剂量（0.692mg/kg）小于CaCCinh-A01（13.6mg/kg）。结论:1.本研究新发现三种分属于不同结构家族的TMEM16A氯离子通道抑制剂,木脂素类化合物（kobusin和松树酯醇二甲醚）能够激活CFTR与CaCCGI氯离子通道,萘醌类化合左旋物紫草素能够抑制CaCCGI氯离子通道。2.Kobusin与松树酯醇二甲醚对TMEM16A与CaCCGI氯离子通道的相反作用为证实TMEM16A与CaCCGI是分子特性不同的两种CaCCs氯离子通道提供了确切证据。3.证实了轮状病毒引起的分泌型腹泻中肠道液体分泌增加主要是通过激活CaCCGI氯离子通道实现的,肠腔侧给药抑制肠道TMEM16A和CaCCGI氯离子通道能够显著减少肠道液体分泌。4.证实了 TMEM16A在肠动力调节中发挥重要作用,抑制TMEM16A能够显著抑制肠道的蠕动。本研究获得的CaCCs调节剂对于阐明生理和CaCCs氯离子通道相关的病理（如便秘和腹泻）条件下TMEM16A、CaCCGI和CFTR这三种氯离子通道在肠道动力学和肠道液体分泌中的作用具有重要的理论意义,为区别分析已知和未知CaCCs氯离子通道的活性提供了分子探针。本研究还可为以CaCCs为靶标的轮状病毒引起的分泌型腹泻治疗提供新的先导化合物和新的治疗策略。