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布鲁氏菌是典型的胞内感染菌,自然感染状态下,由于巨噬细胞表达高丰度的布鲁氏菌模式识别受体,所以成为布鲁氏菌感染的主要靶细胞。研究证明,布鲁氏菌侵入巨噬细胞后可通过抑制TNF-α的分泌而抑制巨噬细胞凋亡,从而可在细胞内生存并大量繁殖,削弱巨噬细胞吞噬功能,使巨噬细胞的杀伤作用与抗原提呈功能部分丧失,最终逃避宿主的免疫监视;另一方面,巨噬细胞激活初始T细胞的能力较弱,也不表达有抗原提呈功能的CD1分子,故不能有效提呈脂类抗原给NKT细胞;这可能是导致布鲁氏菌持续感染形成的原因。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是目前所知功能最强大、且能激活初始性T(na?ve T cell)细胞的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC),不仅可以通过MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类途径提呈抗原,而且还拥有提呈脂类抗原的CD1分子。但由于DCs只表达低丰度的布鲁氏菌模式识别受体,所以捕获布鲁氏菌的能力较弱。为比较两种细胞负载布鲁氏菌后形态学变化,对负载布鲁氏菌后的巨噬细胞与DCs进行姬姆萨染色。结果显示,巨噬细胞负载布鲁氏菌4h,吞噬布鲁氏菌的数量明显增多;在6 h,巨噬细胞出现胞质脱落现象;至8h胞质脱落现象增多,个别细胞的细胞膜几乎完全消失;至12h,大部分巨噬细胞出现了胞质脱落、细胞膜消失与核固缩现象,并有膜包小泡被释放至胞外。而DCs负载布鲁氏菌后4 h,出现细菌与DCs黏附并有少量细菌被吞噬的现象;6 h～8 h DCs吞噬布鲁氏菌的数量明显增多;10 h～12 h黏附现象消失,绝大多数DCs吞噬了布鲁氏菌;以上结果证明,巨噬细胞负载布鲁氏菌后形态结构遭到破坏,而DCs捕获布鲁氏菌后结构始终保持完整。因此为了使DCs发挥其强大抗原提呈作用,避免巨噬细胞在布鲁氏菌感染后造成的免疫缺陷,本试验设计了靶向DCs的新型布鲁氏菌疫苗。布鲁氏菌的脂多糖和外膜蛋白质(outer membrane proteins, OMPs)是构成细菌毒力及免疫原性的重要因素,但脂多糖免疫原性较弱,因此在本试验中选择布鲁氏菌OMPs作为目的抗原。本试验采用去污剂连续抽提与电洗脱的方法,经SDS-PAGE检测,表明分子量为37.5 kD与47.2 kD的两种布鲁氏菌OMPs已被成功提取纯化。随后用两种蛋白质与弗氏佐剂混合乳化,皮下注射BALB/c小鼠,同时用商品布鲁氏菌冻干疫苗作对照,在第4次免疫后收集外周血制备血清。为检测布鲁氏菌OMPs的免疫原性,以纯化的布鲁氏菌蛋白质为抗原,分别与疫苗组和蛋白质组小鼠血清作双向琼脂扩散试验,结果显示,在2倍稀释血清孔周围均出现沉淀线,说明两种蛋白质混合后具有很好的免疫原性。用间接ELISA检测各试验组小鼠血清中IgG的含量(P/N>1.5),检测结果分别为,疫苗组:1:160;蛋白组:1:320;可见2种蛋白免疫效果明显好于疫苗组,因此这2种蛋白质被选作本试验的目的抗原。甘露糖受体(mannose receptor MR)是DCs和巨噬细胞所特有的膜受体,未成熟的DCs表达高水平的MR,能有效地捕获含有甘露糖残基的生物大分子或微生物。但天然布鲁氏菌蛋白含甘露糖残基甚微,因此为增强MR介导的抗原摄取与提呈功能,利用糖基化位点数据库O-GlycBase与糖基化位点预测工具软件,确定了两种蛋白质的糖基化位点为赖氨酸分子上的ε-氨基,采用α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯对两种目的蛋白质抗原进行甘露糖修饰,间苯二酚-硫酸法鉴定结果表明,两种蛋白质抗原已被成功糖基化修饰。随后,把糖基化蛋白质与弗氏佐剂混合乳化,同时用弗氏佐剂混合乳化的纯化蛋白质、弗氏佐剂混合乳化的PBS、商品布鲁氏菌冻干疫苗作对照,BALB/c小鼠皮下注射,第4次免疫后眼球采血制备血清。试管凝集试验表明,蛋白质经糖基化后,与纯化蛋白(抗体效价1:240)和疫苗(抗体效价1:120)免疫效果相比,体液免疫水平明显降低(抗体效价1:10)。ELISA试验结果表明,纯化蛋白质组、糖基化蛋白质组与疫苗组IFN-γ血清水平均显著高于PBS对照组(P<0.01),并且糖基化蛋白质组IFN-γ血清水平明显高于纯化蛋白质组(P<0.01)与疫苗组(P<0.05);而IL-4血清水平除纯化蛋白质组显著高于PBS对照组外(P<0.05),其余两组与PBS对照组相比差异均不显著(P>0.05);说明三种抗原注射后都有效引发了机体的Th1细胞免疫应答,且蛋白质经糖基化修饰后免疫效果显著优于未糖基化蛋白质与布鲁氏菌冻干疫苗。据此推测,蛋白质经糖基化修饰后,提高了DCs吞噬与提呈抗原的作用,从而引起了机体更高水平的细胞免疫应答。为了避免弗氏佐剂的副作用,提高糖基化蛋白质的免疫效果,使糖基化蛋白更好地发挥靶向性作用,本研究选择油包水佐剂50V作为佐剂,与糖基化蛋白混合乳化后接种小鼠,分别在1免后4 d、2免后3 d、5 d、7 d眼球采血制备血清,用ELISA检测血清IFN-γ的含量。布鲁氏菌冻干疫苗免疫后,在1免4d至2免3d,IFN-γ水平呈上升趋势,并且显著高于糖基化蛋白质组与纯化蛋白质组(P<0.05),但2免5 d后,IFN-γ水平急剧下降,至2免7 d,IFN-γ水平显著低于糖基化蛋白质组与纯化蛋白质组(P<0.05),表明布鲁氏菌冻干疫苗接种后虽然在短期内激发了机体高水平的IFN-γ免疫应答,但维持时间较短,且不能产生良好的免疫记忆。而糖基化蛋白质免疫后,IFN-γ水平持续上升,并在2免后5 d至7 d,显著高于纯化蛋白质组与疫苗组(P<0.05),说明糖基化蛋白质免疫后随着佐剂不断被吸收,IFN-γ水平不断上升,激发了机体有效的Th1细胞免疫应答,且免疫水平显著高于未糖基化蛋白质与布鲁氏菌冻干疫苗,并能诱导免疫记忆的形成。本试验结果说明,布鲁氏菌分子质量分别为37.5 kD与47.2 kD的OMPs具有良好的免疫原性,其赖氨酸分子上的ε-氨基经α-D-甘露吡喃异硫氰酸苯酯糖基化修饰后有效提高了DCs的吞噬与抗原提呈作用,从而增强了机体的Th1型细胞免疫应答,因此,开发预防布鲁氏菌病靶向化树突状细胞疫苗是完全可行的。