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目的:缺血性脑中风是严重危害人类健康的常见疾病。为缓解或避免缺血造成的脑损伤,原则上应尽快恢复血供,而脑缺血一段时间后,局部血流再恢复又会引发严重的继发性损伤,即缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤。炎症反应在I/R损伤中发挥关键性作用,因此抑制I/R后的炎症反应,对于脑I/R损伤的治疗具有重要意义。研究发现,δ-阿片受体(delta-opioid,DOR)在脑I/R中起着重要的保护作用,并参与电针(electroacupuncture,EA)抗急性脑I/R损伤,但是与炎症反应的关系,尚缺乏相关文献报道。本实验通过大鼠嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocytoma cell,PC-12)的氧糖剥夺再灌注模型(oxygen-glucose deprivation-reperfusion,OGD/R)和SD大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型(middle cerebral artery occultation,MCAO),从体内、体外两个方面,探讨DOR在脑I/R中的神经保护作用及其抗炎机制。方法:(1)体外实验:运用PC12细胞的OGD/R离体实验模型,体外模拟脑I/R损伤。采用不同OGD/R时间结合缺氧小室诱导PC-12细胞I/R损伤,筛选出适宜的OGD/R时间,并采用OGD6 h/24 R用于后续实验。将对数生长期的PC12细胞随机分为五组:Control组(对照组)、OGD/R组(模型损伤组)、OGD/R+Tan67组(模型损伤加DOR激动剂Tan67组(tan67 dihydrobromide,Tan67)、OGD/R+NTI组(模型损伤加DOR抑制剂NTI组(naltrindole hydrochloride,NTI)、OGD/R+NTI+Tan67组(模型损伤加NTI、Tan67组)。采用倒置显微镜和CCK-8试剂观察并检测各组细胞形态变化和存活率情况。采用LDH试剂盒检测各组细胞的LDH漏出率;采用TUNEL试剂盒检测各组细胞凋亡情况;采用Western blot检测各组细胞DOR蛋白表达情况。采用ELISA检测各组细胞上清和细胞内的BDNF蛋白表达情况。采用q RT-PCR检测各组细胞DOR、Trk B、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10的m RNA表达情况。(2)体内实验:SD大鼠大脑中动脉线栓法制备大鼠脑I/R模型体内模拟脑I/R损伤,将健康雄性SD大鼠随机分为5组:假手术组(Sham,n=8),MCAO组(模型组,n=8),假EA组(EA+S,n=8),EA组(MCAO+EA,n=8),EA+抑制剂组(EA+NTI,n=8);检测术前术后体重变化情况,神经功能评分检测各组大鼠的神经功能损伤情况,CV染色检测各组大鼠脑梗死体积大小,免疫荧光检测各组实验大鼠脑缺血区IL-1β、IL-10的表达情况。(3)为进一步探索DOR在抗脑I/R损伤中的作用,运用小干扰RNA(si RNA)技术,从基因层面上沉默DOR,抑制DOR蛋白的表达。首先筛选PC-12细胞的转染效率及条件;然后采用设计的3条DOR-si RNA(Oprd1-rat-356、Oprd1-rat-509、Oprd1-rat-604)转染PC-12细胞,运用q RT-PCR和Western blot技术检测检测转染PC-12细胞24 h,48 h后DOR蛋白表达水平。确定转染效率与抑制情况为进一步探索DOR抗脑I/R损伤中的作用做前期准备。结果:(1)体外实验结果显示:PC-12细胞经持续性OGD/R损伤后细胞活性降低,突触变短减少,胞体遮光性降低,细胞形态损伤随OGD/R时间的延长而逐渐加重;CCK-8细胞存活率检测结果与形态改变一致,于氧糖剥夺6h再灌注24h情况下PC-12细胞存活率约为60%(P<0.01),选取该时间用于后续实验。CCK-8检测、LDH及TUNNEL试剂盒检测发现,DOR激动剂Tan67可明显提高OGD/R情况下PC-12细胞的存活率(P<0.001),降低PC-12细胞OGD/R后LDH的漏出率(P<0.01),减轻OGD/R诱导PC-12细胞的凋亡(P<0.01),且这一保护作用可被DOR抑制剂NTI阻断。Western Blot检测结果显示DOR激动剂Tan67可部分抑制OGD/R所诱导DOR蛋白的下降(P<0.05),抑制剂NTI可阻断这一作用。ELISA检测显示激活DOR可升高OGD/R诱导PC-12细胞损伤后各组细胞上清和细胞内BDNF含量(P<0.001,P<0.01),这一作用可被抑制剂NTI阻断。q RT-PCR结果显示,DOR激动剂Tan67可明显升高PC-12细胞OGD/R损伤后DOR、Trk B的m RNA表达(P<0.01,P<0.001),降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA表达(P<0.01、P<0.05、P<0.05),同时增加抗炎因子IL-10、IL-4的m RNA表达(P<0.001、P<0.001),先给予抑制剂NTI则可阻断这一作用。以上结果提示DOR可能通过BDNF/Trk B通路发挥神经保护作用,其作用可能通过抑制缺血后炎症反应,减轻细胞凋亡实现的。(2)体内实验结果显示,各组实验动物手术前和手术后24 h的体重变化差异无统计学差异(P>0.05);在神经功能损伤和脑梗死体积方面,与MCAO模型组相比,EA+S组无统计学差异(P>0.05);EA组显示,EA可改善SD大鼠脑I/R后神经功能(P<0.05),而EA的这种治疗作用可被DOR抑制剂NTI翻转(P<0.05)。CV染色结果显示,EA可减小SD大鼠I/R后脑梗死体积(P<0.05),且DOR抑制剂NTI可翻转EA的这种保护作用,EA+NTI组显示梗死体积较大。免疫荧光检测显示,EA可降低脑I/R后SD大鼠脑梗死区炎症因子IL-1β的表达(P<0.01),增加抗炎因子IL-10的表达(P<0.01),给予DOR抑制剂NTI可翻转这种保护效应,EA+NTI炎症因子IL-1β表达较高,抗炎因子IL-10表达较低。以上结果提示DOR可能通过抑制I/R后炎症反应参与EA治疗脑I/R损伤,为EA应用于缺血性中风治疗提供一定的理论基础。(3)siRNA特异性沉默PC-12细胞的DOR基因结果显示,设计的si RNA可成功转染PC-12细胞,转染效率达70%以上。设计的三条DOR-Si RNA序列(Oprd1-rat-356、Oprd1-rat-509、Oprd1-rat-604),运用RT-q PCR及Western检测结果显示在转染24 h、48 h后DOR m RNA及DOR蛋白表达水平均降低,于24 h降低显著,其中Oprd1-rat-509转染24 h后DOR m RNA及蛋白的抑制率均可达60%。结果显示Oprd1-rat-509转染PC-12细胞24 h后可成功沉默DOR基因序列抑制DOR蛋白的表达,可用于进一步的深入研究DOR在抗脑I/R损伤中具体作用与机制。结论:(1)激活DOR对于OGD/R诱导的PC12细胞损伤有明显保护作用,DOR的神经保护作用可能是通过BDNF/Trk B信号通路抑制炎症反应、减少凋亡实现的。(2)EA“人中”、“内关”可减小大鼠脑I/R损伤后脑梗死体积,改善神经功能,降低脑缺血区炎症因子IL-1β的表达,增加抗炎因子IL-10的表达,具有明显的神经保护作用。DOR抑制剂翻转EA的保护作用;提示EA通过DOR-BDNF/Trk B通路抑制炎症反应,发挥对脑I/R的保护作用。(3)Oprd1-rat-509转染PC-12细胞24 h后可有效沉默DOR基因、抑制DOR蛋白的表达,可用于进一步的研究。