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Nogo-66,作为髓鞘抑制蛋白 Nogo-A的主要活性功能片段，与受体(NgR1)结合，在神经发育和再生的过程中发挥多种生物学功能。NgR1在中枢神经系统外伤中发挥非常重要的作用，是抑制神经再生的关键性受体。因此。NgR1被认为是神经再生领域的重要靶点。 目的：本实验通过构建SUMO融合表达系统，获得重组的Nogo-66蛋白。然后运用噬菌体展示技术筛选能够与Nogo-66竞争性结合其受体NgR1的小分子多肽，并验证其生物学功能，为NgR1为靶的小分子多肽治疗神经再生障碍疾病提供新的依据。 方法：1.利用 SUMO融合蛋白系统，采用 PCR方法，构建重组质粒 pET-20b/SUMO-Nogo-66。将重组质粒转化到大肠杆菌中，表达融合蛋白 SUMO-Nogo-66。然后用 SUMO蛋白酶和组氨酸亲和层析纯化，得到重组蛋白 Nogo-66。2.利用Ph.D.-7噬菌体展示肽库，以NgR1为靶点经过四轮生物淘选得到具有高特异性的单克隆噬菌体，用 ELISA检测它们与 NgR1的结合能力。以Nogo-66为基准，分析比对阳性序列的相似度，疏水轮廓。采用细胞免疫荧光实验验证候选肽与 NgR1的结合能力。采用链霉素亲和素结合实验来验证候选肽是否和 NgR1直接结合，并测量其解离常数。用神经元突起抑制模型来研究多肽的促神经再生功能。Western boltting来检测 NgR1下游信号的表达情况。ROCK2，p-CRMP2。p-MLC。 结果：1.构建并获得目的基因SUMO-Nogo-66，将其克隆至载体质粒 pET-20b中，获得重组表达的质粒 pET-20b/SUMO-Nogo-66。在大肠杆菌中过表达重组质粒，获得21kD的融合蛋白，可溶性表达占总蛋白表达量的33％以上。在SUMO蛋白酶和组氨酸亲和层析纯化作用下，获得了单体重组蛋白 Nogo-66，产量为23 mg/L，纯度为93%。2.经过四轮生物淘选，获得的30个阳性克隆，从中选定了8个候选肽。候选肽 NAP2(HIYTALV)与 NgR1高亲和力的配体Nogo-661-7(RIYKGVI)及 Nogo-6627-33(AISEELV)有两个相同的氨基酸，与Nogo-66带同样的电荷，具有较高的相似性，与其他候选肽相比，NAP2更有可能阻断 Nogo-66与受体 NgR1的结合，因此选定NAP2为先导肽。细胞荧光共定位实验也表明，NAP2可以特异性的与NgR1结合。链霉素亲和素结合实验显示，NAP2与受体NgR1能够特异性结合，解离常数(Kd)为0.45μM。NAP2的生物学功能表明，NAP2可拮抗 Nogo-66引起的神经突起生长抑制作用，促进神经突起再生，降低NgR1受体下游蛋白ROCK2，p-CRMP2。p-MLC的表达。 结论： 1.成功构建了 SUMO融合蛋白表达系统，获得了重组蛋白 Nogo-66，产量为23 mg/L，纯度为93%。 2.利用噬菌体展示技术成功筛选并分离到了Nogo-66受体拮抗肽NAP2。NAP2与受体NgR1结合，Kd为0.45μM， 3. NAP2能缓解 Nogo-66引起的神经生长突起抑制作用，促进神经突起再生，并且降低NgR1受体下游信号蛋白ROCK2，p-CRMP2，p-MLC的表达。