过去的十年间,表观遗传的异常能够导致癌症是在癌症研究方面取得的最令人瞩目的成就。染色质开放状态作为一种重要的表观遗传信息,在癌症的发生发展过程中起着重要的作用。呈开放状态的染色质区域为转录因子(transcription factor,TF)的结合提供了可能,而转录因子通过调控基因的表达同样也在癌症过程中有着关键作用。因此,对癌症细胞的染色质开放状态以及与之相结合的转录因子的结合特征进行分析对于认识和治疗癌症都具有重要意义。游离DNA(cell free DNA,cfDNA)作为液体活检的重要材料来源,在癌症相关的突变检测中发挥着重要作用。进一步拓展cfDNA的应用范围,使其能够用于染色质开放状态的检测,成为癌症诊断更加有力的工具,在癌症检测领域也具有极大的应用价值。而二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)在上述研究中均发挥着重要作用。本研究针对上述几方面展开研究,开发出研究染色质开放状态、cfDNA的新方法,并对NF-κB在HeLa细胞中的结合特征进行了分析,取得以下结果:1.高通量鉴定染色质开放状态的SALP方法建立NGS是当前生物和生物医学研究的基础。构建测序文库则是二代测序过程中的关键环节。因此,大量高通量测序文库构建方法被开发出来,但是当前的这些文库构建方法仍存在较多不足,限制了它们的应用范围。本研究基于新型单链接头(single strand adaptor,SSA),开发了一种新型的NGS文库构建方法—单链接头文库制备(single strand adaptor library preparation,SALP)。SSA是一段在3′端突出3个随机碱基的双链DNA,该接头在T4 DNA连接酶的作用下能够高效地与单链DNA的3′端连接。SALP能够以各种来源的DNA片段作为起始物,如Tn5片段化的DNA(tagmented DNA)、限制性内切酶酶切片段,以及超声剪切后的DNA片段等。以Tn5片段化后的染色质构建文库时,SALP能够克服ATAC-seq的不足,成为一种高通量的NGS文库构建方法,SALP-seq,能够以无偏倚的方式对多种细胞的染色质开放状态进行比较。通过该方法,本研究成功对GM12878、HepG2、HeLa和293T四种细胞的染色质开放状态进行了比较。同时,利用SALP-seq成功地对不同数量HepG2细胞(500?10~5)的染色质开放状态进行了分析比较。另外,SALP-seq鉴定出不同细胞系中MYC基因超级增强子和TERT基因启动子区的染色质开放状态的差异,这些发现有助于研究重要基因的转录因子结合情况以及转录调控机制的细胞特异性。基于四种不同细胞系的SALP-seq数据鉴定出了137个新的潜在癌症相关基因。本研究开发的新型NGS文库构建方法SALP,由于具有极高的效率及易用的优势,在多个方面具有应用价值。2.利用SALP-seq鉴定多种细胞染色质开放状态表观遗传的异常是人类癌症的共同特征,染色质开放状态是表观遗传学的重要内容,因此对不同癌细胞以及正常细胞的染色质开放状态鉴定具有重要意义。本研究利用SALP-seq对人细胞系PANC-1、A549、HT29、SKOV3、SiHa、C-33A、HL7702、MRC-5、小鼠细胞系Hepa1-6,以及BALB/C小鼠肝脏细胞的染色质开放状态进行了分析。与上述GM12878、HepG2、HeLa细胞的染色质状态进行联合分析,多角度比较了不同细胞之间的差异。发现在正常细胞系和癌症细胞系、不同类型的癌症细胞系、两种正常细胞系、宫颈癌的不同亚型,以及相同组织的癌细胞和正常细胞之间,都存在明显的染色质状态差异。正常细胞与癌细胞之间的染色质开放程度及转录因子结合的差异分析,为癌症的治疗提供了新的潜在靶点。MRC-5和HL7702细胞之间的染色质状态差异,从表观遗传学的角度成功揭示了iPSC细胞诱导中成纤维细胞被广泛使用的原因。不同宫颈癌细胞之间染色质开放状态的差异,揭示了HPV在宫颈癌发病过程中的重要作用,同时为针对不同HPV亚型感染靶向治疗宫颈癌提供了重要依据。3.用改进的SALP-seq解析cfDNA中的遗传和表观遗传信息人血浆中的游离DNA(cfDNA)携带有关生理和病理状况的丰富信息,因此已成为无创产前无创检测(NIPT)和液体活检的重要样本。特别是随着下一代测序(NGS)技术的快速发展,cfDNA中编码的遗传和表观遗传信息得到了有效、广泛的解析。在此过程中,关键步骤是构建NGS文库。由于cfDNA高度降解,基于单链的文库构建方法被认为更适合构建cfDNA NGS文库。为了发明一种更加简便的新方法来构建cfDNA NGS文库,本研究对上述SALP-seq方法进行了改进,使其能够更适合构建cfDNA NGS文库。在改进的SALP方法中,首先将cfDNA变性为单链DNA,然后与SSA在T4DNA连接酶作用下连接。之后通过Taq聚合酶的作用,连接了SSA的单链DNA延伸形成末端突出一个腺嘌呤的双链DNA。随后,将一个带有标签的T接头(barcode T adaptor,BTA)连接在该末端。最后,连接了两个不同接头的cfDNA通过Illumina测序平台兼容的PCR引物进行扩增,形成最终的测序文库。使用该方法,本研究成功对来自16名食管癌患者和4名健康人的20种cfDNA样品进行了高通量测序。通过生物信息学分析,本研究发现患者和健康人之间的遗传和表观遗传差异,并鉴定出了23个在表观遗传水平上,以及28个在遗传水平上发生变化的食管癌相关基因。4.HeLa细胞中NF-κB结合特征分析NF-κB是一种序列特异性的转录因子。鉴定该转录因子在基因组中的结合位置,对于揭示其在细胞内部调节基因表达的机制有着十分关键的作用。本研究通过一种精确的染色质免疫沉淀方法,鉴定了NF-κB RelA/p65在肿瘤坏死因子(TNFα)诱导的人宫颈癌细胞株(HeLa)中的结合位点。结果表明,NF-κB的非经典模体(nontraditional motifs,nt-motifs)包含有保守的GGAA。并且,非经典模体主要分布在着丝粒附近的结合峰(peak)中,这些peak中含有大量的如卫星序列(satellite)、简单重复序列(simple repeats)以及短重复分散序列(short interspersed nuclear elements,SINEs)。这种细胞内的结合方式,首先通过细胞外实验进行验证,结果表明NF-κB二聚体能够与非经典κB位点(nontraditionalκB site)以较低亲和性的方式结合。然而,这种结合很难激活转录过程。据此,本研究推测,不同于NF-κB与经典模体的结合(traditional motifs,t-motifs),发挥基因调控的作用;与非经典模体结合,可能发挥另外的功能。为了验证该假设,本研究对多组不同细胞的ChIP-seq数据进行了分析。结果表明,在其他不同的细胞中,NF-κB与非经典模体结合的现象也普遍存在。这些ChIP-seq数据的分析结果同时表明,非经典模体在富集倍数(fold enrichment)较低的peak中分布更为广泛。更为重要的是,对ChIP-seq数据分析结果表明,NF-κB与非经典模体结合主要出现在未诱导的静息细胞中,而与经典模体的结合,主要出现在诱导后的细胞中。而这些含有非经典模体的peak并未富集出已知的生物学功能。基于这些结果,本研究提出,这些在重复序列中大量分布的NF-κB非经典模体,主要发挥贮存NF-κB的功能。在静息状态下时,细胞核内的NF-κB蛋白储存在这些非经典结合位点,当细胞受到刺激时,能够被召集到经典结合位点,发挥调控基因表达的作用。综上所述,本研究开发出了新型NGS文库构建方法,能够高通量低偏倚地对多种样品的染色质可及性进行分析。利用该方法,对13种不同细胞系及一种组织样本的染色质开放状态进行了鉴定,并从多个角度对不同样本之间的染色质开放状态差异进行了比较。对该方法进一步改进后,对cfDNA进行研究,并成功的将cfDNA在癌症检测中的应用拓展至表观遗传学水平,极大的丰富了cfDNA的应用范围;并发现了食管癌中高表达的23个基因,为食管癌的检测提供了新靶标。对NF-κB结合特征的分析,为基因组中高度重复序列在表达调控中发挥的重要作用提供了有力依据。