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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的感染是一个全球性的健康问题,全世界有约3.5亿的乙肝病毒携带者,中国就有1亿的乙肝病毒携带者,所以对于中国来说,乙肝病毒感染的形势更加严峻。乙肝病毒感染会引起肝炎,肝纤维化和肝硬化,更严重的会导致肝癌。HBV是一种小DNA病毒,其基因组只有大约3.2kb,结构非常紧密,各个开放阅读框有重叠。HBV的复制周期中有逆转录过程,所以突变率非常高,有多种不同的型和亚型,同一病人体内的病毒往往是多种基因型病毒的混合体。乙肝病毒在感染宿主细胞后会在宿主细胞核内形成一种共价闭合环状的 DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),这种 DNA结合细胞的组蛋白形成小染色体的形式稳定存在于宿主细胞核中,并作为乙肝病毒转录复制的模板,可以产生新的病毒。cccDNA的稳定性是HBV感染难以被清除的主要原因,目前的药物虽然能抑制病的复制,但是不能清除cccDNA,一旦停止用药,病毒就会以cccDNA作为库大量产生,所以对cccDNA的清除成为乙肝治疗的一个主要目标。已经有课题组尝试利用ZFN和TALEN等基因编辑技术来直接靶向乙肝病毒的cccDNA,从而抑制病毒复制。在我们的研究中,我们利用CRISPR/Cas9系统直接靶向HBV的基因组,来探究这种最新的基因编辑系统对乙肝病毒的抑制和清除作用。CRISPR/Cas9系统相对于以前的基因编辑工具来说,使用更加简单同时基因编辑效率更高。我们综合考虑了乙肝病毒突变性高的特点,在比对了 26种不同基因型的病毒基因组序列后找到保守区域,然后针对这些保守区域设计了8条CRISPR/spCas9系统的gRNA,这8条spgRNA靶向HBV基因组的不同区域,覆盖了所有蛋白的开放阅读框。在细胞模型中,8条spgRNA以及其混合物都能非常明显地降低细胞中和培养上清中的病毒DNA以及病毒的RNA。更进一步的实验研究表明我们设计的HBV特异性的CRISPR/Cas9系统能抑制不同基因型的HBV,同时在体内实验中也表现出非常好的抑制效果。我们还探究了CRISPR/Cas9系统对HBV抑制的机制,发现HBV基因组可以被该基因编辑系统特异性切割,并且被切割后的HBVDNA只有小部分被细胞的NHEJ机制修复而产生突变,大部分都被降解了,特别是8条gRNA同时作用时,基本检测不到突变。我们的实验结果也显示8条gRNA同时作用时对HBV的抑制效果最好。最后考虑到将来的临床给药问题,我们综合考虑各种载体的优缺点选择AAV8作为基因编辑工具的载体来将CRISPR/Cas9系统特异性导入到人的肝脏细胞中,为此我们选用了基因长度较短的saCas9,并针对HBV基因组的保守区域设计了7条sagRNA,并在细胞中验证了这7条sagRNA及其混合物对HBV复制的抑制作用,同时比较了其和spCas9对HBV的抑制效率。