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运动裨益身体健康,其在心血管疾病的预防和治疗中的作用日益受到关注。运动对心血管的保护作用很大程度上有赖于改善器官的血液灌注和增加血管密度。而运动如何促进组织中的血管生成,其机制尚未完全阐明。外泌体是一种由细胞主动分泌的,广泛分布于各种体液之中的胞外囊泡,作为一种新的细胞间信号传递的形式,参与多种生命活动的调节。在前期的研究中,我们发现长期有氧运动大鼠循环外泌体的量并没有明显差异,但循环外泌体中多种mi RNA含量发生了显著改变,其中循环外泌体中上调的mi R-342-5p可以到达心肌,通过抗心肌凋亡促进生存发挥心肌保护作用。于是本研究拟探索运动来源外泌体中差异表达的mi RNA是否参与了运动引起的血管新生作用。实验目的1.筛选运动来源外泌体中对内皮细胞增殖有促进作用的mi RNA,验证其在运动促血管新生过程中的作用。2.进一步探索筛选出的mi RNA发挥促血管新生作用的机制。实验方法1.采用3天适应性训练联合9天跑台训练构建有氧运动小鼠模型。2.采用WB与免疫荧光的方法评价股四头肌血管密度,Quantity One软件计算条带灰度值,image J图像分析软件量化荧光密度。3.分离培养原代小鼠内皮细胞,通过体外细胞增殖实验筛选有促内皮细胞增殖作用的有氧运动来源外泌体中差异表达的mi RNA。并采用内皮细胞的划痕实验、成管实验、出芽实验评价内皮细胞血管新生能力。4.采用骨骼肌点注射Agomi R上调局部mi RNA的水平,通过尾静脉注射反义链Antagomi R干预运动对循环中该mi RNA的升高作用。5.采用在线数据库靶基因预测联合PCR验证手段,探索筛选出的mi RNA发挥促血管新生作用的可能靶分子。6.si RNA下调特定蛋白的表达水平验证mi RNA的作用机制。7.在体创伤愈合实验与基质胶埋置实验探索该mi RNA作为促血管新生药物的应用潜力。8.两组之间比较采用t检验,三组或三组以上采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),Bonferroni校正分析任意两组间统计学差异。实验数据用“均数±标准误”(Mean±SEM)表示,P<0.05认为存在统计学差异。实验结果1.首先,WB与免疫荧光结果显示,3天适应性训练联合9天中高强度跑台训练显著增加小鼠股四头肌血管密度,提高了骨骼肌促血管生成的细胞因子VEGF的表达。2.体外实验筛选了前期测序获得的运动来源外泌体中差异表达的15个mi RNA,筛选出mi R-122-5p可以显著促进内皮细胞增殖,WB结果显示mi R-122-5p可以增加内皮细胞血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,内皮细胞迁移实验、成管实验和出芽实验证实mi R-122-5p提高内皮的血管新生能力。3.WB与免疫荧光结果显示,点注射Agomi R-122-5p的股四头肌组织与注射Agomi R-NC的对照组相比,VEGF以及血小板内皮细胞粘附分子-1(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31)的蛋白水平都有所上升,横截面上单位面积下CD31的密度升高,提示骨骼肌点注射Agomi R-122-5p可以增加局部的血管密度。4.PCR结果显示与安静对照组相比,运动对照组小鼠循环中mi R-122-5p水平上升,尾静脉注射反义链Antagomi R-122-5p的运动组与安静组间,循环mi R-122-5p的水平无明显差异。骨骼肌组织的WB结果显示,与安静对照组相比,运动对照组骨骼肌的VEGF与CD31表达水平升高,而给予Antagomi R-122-5p的运动组与安静组相比,骨骼肌的VEGF与CD31表达水平无明显改变。免疫荧光结果显示股四头肌单位面积下CD31的荧光仅在运动对照组中有显著上调。以上结果提示运动发挥的促血管新生作用一定程度上依赖于循环中mi R-122-5p的升高。5.给予内皮细胞mi R-122-5p mimic转染处理,BODIPY游离脂肪酸探针检测结果显示mi R-122-5p mimic处理后内皮细胞BODIPY荧光强度增加,WB结果显示mi R-122-5p可以显著上调CD36和肉碱酯酰转移酶1a(Carnitine palmitoyltransferase 1a,CPT1a)的表达,提示mi R-122-5p增加内皮细胞对脂肪酸的摄取和利用。以棕榈酸钠作为脂肪酸供体培养内皮细胞,细胞实验结果显示升高的脂肪酸促进内皮细胞的增殖、迁移以及出芽能力。si RNA敲低CD36干预内皮细胞的脂肪酸代谢可以一定程度上减弱mi R-122-5p对内皮细胞增殖、迁移、成管和出芽能力的促进作用。以上结果显示脂肪酸可以促进内皮细胞的血管新生作用,而mi R-122-5p的促血管新生能力一定程度上依赖于其对内皮细胞脂肪酸代谢的调节。6.骨骼肌点注射动物模型的WB结果显示,Agomi R-122-5p上调骨骼组织中CD36与CPT1a的蛋白水平,免疫荧光结果显示,Agomi R-122-5p点注射组股四头肌血管组织中与CD31共定位的CD36与CPT1a荧光强度增加,进一步证实mi R-122-5p通过上调血管组织脂肪酸代谢相关蛋白的表达。7.在体创伤愈合实验结果显示尾静脉注射Agomi R-122-5p可以加快小鼠创伤愈合的速度,基质胶埋置实验中混合Agomi R-122-5p组基质胶中血管的密度较对照组增加。结论本研究发现运动后循环中升高的mi R-122-5p有促进血管新生的作用。mi R-122-5p通过上调内皮细胞CD36与CPT1a的水平,增加内皮细胞脂肪酸代谢,从而提高内皮细胞的VEGF表达以及血管新生能力。而运动的促血管新生作用一定程度上依赖于循环mi R-122-5p的升高,提示mi R-122-5p作为一种潜在的运动因子或可应用于促血管新生与创伤愈合的治疗实践中。