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【目的】
1.MiR-146a是否通过调控小胶质细胞的功能从而缓解阿尔茨海默病(AD)的病程发展。
2.寻找miR-146a挽救AD病程发展的新靶基因。
【方法】
1.(1)予体外炎症刺激[脂多糖(LPS)或β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42寡聚体]刺激人小胶质细胞(HMC3)，经qRT-PCR检测各组细胞的miR-146a表达量，ELISA检测细胞上清液的IL-6的表达量；(2)在体外炎症刺激(LPS或Aβ1-42)下的人小胶质细胞(HMC3)中过表达miR-146a，分为(①LPS刺激组：MimicsNC、LPS+mimicsNC、Mimics、LPS+mimics(干预组)和②Aβ1-42刺激组：MimicsNC、Aβ+mimicsNC、Mimics、Aβ+mimics(干预组))共8组；经qRT-PCR检测各组miR-146a、小胶质细胞M1/M2型极化的标志物表达水平；ELISA检测各组细胞炎性因子分泌水平；免疫荧光和免疫印迹检测各组细胞吞噬能力。(3)HMC3与人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)以1∶2的比例共培养，予(2)所述处理后经流式细胞术检测SH-SY5Y的凋亡百分比。
2.对12月龄的APP/PS1双转基因小鼠(AD组)、鼻腔给予miR-146aagomir的APP/PS1小鼠(ADI组)以及C57BL/6J小鼠(Con组)的海马组织行转录组数据对比分析，生物信息学手段挖掘miR-146a挽救AD病程发展的下游靶基因；并在细胞与动物水平中进一步通过免疫印迹、双荧光素酶试验验证预测所得候选基因是否是miR-146a的靶基因。
【结果】
1.LPS与Aβ1-42刺激HMC3后，其miR-146a与IL-6表达水平：①LPS刺激组：与对照组(LPS：0ng/ml)相比，100ng/mlLPS刺激HMC3后其miR-146a的表达随刺激时间延长而逐渐增加，刺激48h时达最大值(P＜0.001)，其IL-6分泌水平也逐渐增加；500ng/mlLPS刺激HMC3的12h~72h里，其miR-146a的表达水平均比100ng/mlLPS组高，48h时达最大值(P＜0.001)，IL-6分泌水平在3h~72h均比100ng/mlLPS组高。②在Aβ1-42刺激组中，与对照组(Aβ1-42：0μM)相比，5μM和20μMAβ1-42刺激组的miR-146a的表达水平在12h以内无明显变化，24h达最大值(P＜0.01)，随后至72h逐渐降低；IL-6分泌水平呈先增高后下降的趋势，5μM组12h达分泌高峰(P＜0.01)，20μM组6h达分泌高峰(P＜0.01)。
2.MiR-146amimics下调炎症刺激下小胶质细胞的炎性因子分泌：①qRT-PCR示与mimicsNC组相比，mimics组的miR-146a明显增高(P＜0.05)；②ELISA示，与LPS+MimicsNC组相比，LPS+Mimics组的细胞上清液中的IL-6表达下降(P＜0.01)；与Aβ+MimicsNC组相比，Aβ+Mimics组的IL-6表达下降(P＜0.05)。
3.MiR-146amimics促进炎症刺激下小胶质细胞向M2型极化：qRT-PCR检测，①LPS刺激组：与LPS+mimicsNC组相比，LPS+mimics组的IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平下降(P＜0.01，P＜0.001，P＜0.05)，Arg1和TGF-β表达水平升高(P＜0.01，P＜0.05)；②Aβ1-42刺激组：与Aβ+mimicsNC组相比，Aβ+mimics组的IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)，Arg1和TGF-β表达水平升高(P＜0.05，P＜0.05)。
4.MiR-146amimics抑制炎症刺激下小胶质细胞的激活：免疫荧光检测：LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组和Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的细胞面积，Ferets直径，周长，IOD值均降低(P＜0.001)。
5.MiR-146amimics增强炎症刺激下小胶质细胞的吞噬能力：①免疫荧光检测，LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组和Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的每个小胶质细胞吞噬的荧光微球增多(P＜0.001，P＜0.001)；②免疫印迹检测：LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组的MFG-E8表达增高(P＜0.01)；Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的MFG-E8表达增高(P＜0.01)。
6.HMC3与SH-SY5Y的共培养：HMC3与SH-SY5Y以1∶2的比例直接共培养：在正常条件下，HMC3与SH-SY5Y可行共培养，其形态与贴壁能力正常。
7.MiR-146amimics通过HMC3减轻炎症对SH-SY5Y刺激造成的凋亡:AnnexinV-PE/7-AAD凋亡流式检测法检测，miR-146a+LPS组的SH-SY5Y细胞凋亡率较mimicsNC+LPS组下降(P＜0.05)；miR-146a+Aβ组的SH-SY5Y细胞凋亡率较mimicsNC+LPS组下降(P＜0.05)。
8.MiR-146a在AD病程中的靶基因预测：mRNA测序结果与miRNA数据库与结合，提示Srsf6，Stx3，Psmd3和Rgs11为miR-146a调控AD的潜在功能靶基因。
9.Srsf6是miR-146a在AD病程中的靶标：免疫印迹示miR-146a能在体内与体外抑制Srsf6的蛋白表达水平；双荧光素酶试验示Srsf6是miR-146a的直接靶标，其结合位点为209-216。
【结论】
1.炎症刺激下小胶质细胞内源表达的miR-146a不足以抑制其炎性因子分泌。
2.过表达miR-146a促进炎症刺激下小胶质细胞的M2型极化，抑制其炎性因子分泌并增强其吞噬能力。
3.过表达miR-146a的小胶质细胞可缓解炎症刺激对神经元的损伤。
4.Srsf6为miR-146a参与AD病程的新靶基因。
1.MiR-146a是否通过调控小胶质细胞的功能从而缓解阿尔茨海默病(AD)的病程发展。
2.寻找miR-146a挽救AD病程发展的新靶基因。
【方法】
1.(1)予体外炎症刺激[脂多糖(LPS)或β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42寡聚体]刺激人小胶质细胞(HMC3)，经qRT-PCR检测各组细胞的miR-146a表达量，ELISA检测细胞上清液的IL-6的表达量；(2)在体外炎症刺激(LPS或Aβ1-42)下的人小胶质细胞(HMC3)中过表达miR-146a，分为(①LPS刺激组：MimicsNC、LPS+mimicsNC、Mimics、LPS+mimics(干预组)和②Aβ1-42刺激组：MimicsNC、Aβ+mimicsNC、Mimics、Aβ+mimics(干预组))共8组；经qRT-PCR检测各组miR-146a、小胶质细胞M1/M2型极化的标志物表达水平；ELISA检测各组细胞炎性因子分泌水平；免疫荧光和免疫印迹检测各组细胞吞噬能力。(3)HMC3与人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)以1∶2的比例共培养，予(2)所述处理后经流式细胞术检测SH-SY5Y的凋亡百分比。
2.对12月龄的APP/PS1双转基因小鼠(AD组)、鼻腔给予miR-146aagomir的APP/PS1小鼠(ADI组)以及C57BL/6J小鼠(Con组)的海马组织行转录组数据对比分析，生物信息学手段挖掘miR-146a挽救AD病程发展的下游靶基因；并在细胞与动物水平中进一步通过免疫印迹、双荧光素酶试验验证预测所得候选基因是否是miR-146a的靶基因。
【结果】
1.LPS与Aβ1-42刺激HMC3后，其miR-146a与IL-6表达水平：①LPS刺激组：与对照组(LPS：0ng/ml)相比，100ng/mlLPS刺激HMC3后其miR-146a的表达随刺激时间延长而逐渐增加，刺激48h时达最大值(P＜0.001)，其IL-6分泌水平也逐渐增加；500ng/mlLPS刺激HMC3的12h~72h里，其miR-146a的表达水平均比100ng/mlLPS组高，48h时达最大值(P＜0.001)，IL-6分泌水平在3h~72h均比100ng/mlLPS组高。②在Aβ1-42刺激组中，与对照组(Aβ1-42：0μM)相比，5μM和20μMAβ1-42刺激组的miR-146a的表达水平在12h以内无明显变化，24h达最大值(P＜0.01)，随后至72h逐渐降低；IL-6分泌水平呈先增高后下降的趋势，5μM组12h达分泌高峰(P＜0.01)，20μM组6h达分泌高峰(P＜0.01)。
2.MiR-146amimics下调炎症刺激下小胶质细胞的炎性因子分泌：①qRT-PCR示与mimicsNC组相比，mimics组的miR-146a明显增高(P＜0.05)；②ELISA示，与LPS+MimicsNC组相比，LPS+Mimics组的细胞上清液中的IL-6表达下降(P＜0.01)；与Aβ+MimicsNC组相比，Aβ+Mimics组的IL-6表达下降(P＜0.05)。
3.MiR-146amimics促进炎症刺激下小胶质细胞向M2型极化：qRT-PCR检测，①LPS刺激组：与LPS+mimicsNC组相比，LPS+mimics组的IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平下降(P＜0.01，P＜0.001，P＜0.05)，Arg1和TGF-β表达水平升高(P＜0.01，P＜0.05)；②Aβ1-42刺激组：与Aβ+mimicsNC组相比，Aβ+mimics组的IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)，Arg1和TGF-β表达水平升高(P＜0.05，P＜0.05)。
4.MiR-146amimics抑制炎症刺激下小胶质细胞的激活：免疫荧光检测：LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组和Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的细胞面积，Ferets直径，周长，IOD值均降低(P＜0.001)。
5.MiR-146amimics增强炎症刺激下小胶质细胞的吞噬能力：①免疫荧光检测，LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组和Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的每个小胶质细胞吞噬的荧光微球增多(P＜0.001，P＜0.001)；②免疫印迹检测：LPS+mimics组较LPS+mimicsNC组的MFG-E8表达增高(P＜0.01)；Aβ+mimics组较Aβ+mimicsNC组的MFG-E8表达增高(P＜0.01)。
6.HMC3与SH-SY5Y的共培养：HMC3与SH-SY5Y以1∶2的比例直接共培养：在正常条件下，HMC3与SH-SY5Y可行共培养，其形态与贴壁能力正常。
7.MiR-146amimics通过HMC3减轻炎症对SH-SY5Y刺激造成的凋亡:AnnexinV-PE/7-AAD凋亡流式检测法检测，miR-146a+LPS组的SH-SY5Y细胞凋亡率较mimicsNC+LPS组下降(P＜0.05)；miR-146a+Aβ组的SH-SY5Y细胞凋亡率较mimicsNC+LPS组下降(P＜0.05)。
8.MiR-146a在AD病程中的靶基因预测：mRNA测序结果与miRNA数据库与结合，提示Srsf6，Stx3，Psmd3和Rgs11为miR-146a调控AD的潜在功能靶基因。
9.Srsf6是miR-146a在AD病程中的靶标：免疫印迹示miR-146a能在体内与体外抑制Srsf6的蛋白表达水平；双荧光素酶试验示Srsf6是miR-146a的直接靶标，其结合位点为209-216。
【结论】
1.炎症刺激下小胶质细胞内源表达的miR-146a不足以抑制其炎性因子分泌。
2.过表达miR-146a促进炎症刺激下小胶质细胞的M2型极化，抑制其炎性因子分泌并增强其吞噬能力。
3.过表达miR-146a的小胶质细胞可缓解炎症刺激对神经元的损伤。
4.Srsf6为miR-146a参与AD病程的新靶基因。