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摘要:水产养殖业多年来蓬勃发展,目前已是许多沿海国家经济支柱产业之一,而在对虾的养殖的过程中,如白班综合征等对虾养殖病给对虾养殖产业形成较大冲击,成为阻碍其发展的瓶颈。其中,对虾白斑病毒和传染性皮下及造血组织坏死病毒是感染对虾的两种重要的DNA病毒,虾肝肠胞虫为其主要病原寄生虫,副溶血弧菌为水产常见食源性致病微生物。目前还没有针对前三者的特效药,且对虾本身较弱的免疫系统,对虾养殖病的防治带来了极大的困难,针对上述水生病原微生物进行早期诊断和预防尤为重要。本研究根据4种水产病原,包括对虾白斑病毒的VP28基因(GenBank登录号:DQ681069.1),传染性皮下及造血组织坏死性病毒的CP基因(GenBank登录号:KF214742.1),虾肝肠胞虫的ssu rRNA基因(GenBank FJ496356.1)以及副溶血弧菌的toxR基因(GenBank登录号:GQ228073.1)分别设计特异性LAMP引物并基于新型DNA荧光染料SYTO-16建立了环介导等温扩增检测方法,通过探究LAMP引物浓度、Bst 2.0酶量以及温度变化对LAMP扩增体系的影响来优化反应体系,分别建立了WSSV、IHHNV、EHP以及VP的高效实时荧光定量LAMP快速检测方法。根据染料筛选结果,SYTO-16在进行LAMP检测时,综合扩增效率、信噪比以及相对荧光值表现更为突出,其工作浓度为10-100μM。本研究以10μM的SYTO-16染料为基础,建立实时荧光定量LAMP体系。通过优化实验体系,确定引物组最优浓度为40μM,Bst 2.0 DNA聚合酶最优浓度为8 U/mL,最优温度为63-64℃。特异性试验显示,4组LAMP体系特异性良好,均只检出对应的阳性目标,与其它水产病原微生物无交叉反应。4组高效实时荧光定量LAMP快速检测方法灵敏度高,WSSV的检出限为1.37×10~1 copies/μL,IHHNV的检出限为1.54×10~1 copies/μL,EHP的检出限为1.78×10~1 copies/μL,VP的检出限为1.68×10~1 copies/μL。qPCR方法学对照结果表明,灵敏度与LAMP结果一致。4组LAMP检测体系,扩增效率较高,可在5-8 min完成对高拷贝浓度模板的检测。在实际样品的检测中,WSSV-LAMP法的检出率为22.6%,WSSV-qPCR法的检出率为21.8%,两种方法的符合率为96.6%;IHHNV-LAMP法的检出率为38.9%,IHHNV-qPCR法的检出率为37.0%,两种方法的符合率为95.9%;EHP-LAMP法的检出率为31.0%,EHP-qPCR法的检出率为30.2%,两种方法的符合率为96.9%;VP-LAMP法的检出率为47.1%,VP-qPCR法的检出率为46.3%,两种方法的符合率为97.5%。本研究基于新型DNA荧光染料SYTO-16初步建立了实时荧光定量LAMP方法检测对虾白斑病毒、传染性皮下及造血组织坏死性病毒、虾肝肠胞虫和副溶血弧菌,并与荧光定量PCR方法进行了方法学对照,结果显示高效实时荧光定量LAMP灵敏度实验高,引物特异性好,无交叉反应,检测时间短且仪器依赖度低,为水产病原快速诊断提供新的检测思路。