背景与目的肺癌是世界第一大癌症,其发病率和死亡率位列第一,且在我国的恶性肿瘤中死亡率最高。根据肺癌的病理分型,非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占比很高。肺癌的临床治疗早期以手术联合放化疗为主,晚期以放化疗保守治疗,但绝大多数临床诊断病例多已为晚期,失去了外科手术机会,晚期肺癌预后极差,5年生存率极低。NSCLC的治疗进展得益于对NSCLC致病基因组改变的更深入了解,因此从基因调控等方面深入探索NSCLC发生机制,找寻早期诊断方法和治疗靶点是很必要的。非编码RNA在肿瘤发生发展中有重要作用,形成复杂的调控网络。环状RNA（CircRNAs）是一种特殊的非编码RNA,在肿瘤发生中通过可多种方式起重要的调控作用,影响疾病的发生发展。现阶段的研究我们可知,环状RNAs（CircRNAs）通过海绵miRNAs（MicroRNAs）在各种不同类型的癌症中发挥重要作用。然而,它们在NSCLC中的作用机制仍很不清楚。在本研究中,我们系统地研究了 NSCLC癌组织和配对的癌旁组织中CircRNA的表达谱,得出NSCLC组织中hsa_circ₀054284的表达水平显著低于癌旁正常组织,且生物信息学分析发现其与在多种肿瘤中起调控作用的miR-18a-3p存在相互作用的碱基互补配对序列。提示hsa_circ₀054284在NSCLC中可能具有重要意义,但其在NSCLC中具体作用及机制尚未有相关报道。在此研究中,首先证实NSCLC组织和细胞中hsa_circ₀054284以环状形式存在且是低表达,并探索上调该hsa_circ₀054284表达对NSCLC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,进而用生信分析和双荧光素酶报告实验等检测hsa_circ₀054284的可能miRNA靶点和下游基因,观测其相互作用对NSCLC细胞生物学行为的影响,初步探索hsa_circ₀054284在NSCLC中的作用及机制,便于发现早期诊断和治疗的新途径。此文分为两部分:第一部分:验证hsa_circ₀054284在NSCLC组织及细胞系中的存在形式,检测其表达水平并研究其对NSCLC细胞增殖、侵袭和凋亡的调控作用;第二部分:初步探索hsa_circ₀054284调控NSCLC细胞生物学行为的相关机制。第一部分 hsa_circ₀054284的表达及对NSCLC细胞增殖、侵袭和凋亡的调控作用方法1.按照规定标准收集NSCLC组织标本及癌旁正常组织标本。2.PCR和DNA测序验证NSCLC组织标本和细胞系中hsa_circ₀054284的存在。3.用荧光定量PCR方法（qRT-PCR）检测30对NSCLC组织和癌旁正常组织hsa_circ₀054284的表达水平。4.合成上调hsa_circ₀054284表达的过表达载体及无关序列,用LipofectamineTM2000分别转染至NSCLC细胞系A549和H520细胞中,hsa_circ₀054284的表达水平用qRT-PCR检测。5.CCK-8实验检测上调hsa_circ₀054284对A549和H520细胞增殖能力的影响。6.Transwell实验检测上调hsa_circ₀054284对A549和H520细胞侵袭能力的影响。7.流式细胞术实验检测上调hsa_circ₀054284对A549和H520细胞凋亡能力的影响。8.为研究上调hsa_circ₀054284是否有抑制裸鼠移植瘤增生的情况,构建将hsa_circ₀054284慢病毒表达载体,制备hsa_circ₀054284过表达重组慢病毒,感染A549细胞,2组A549细胞（circ-EX、circ-NC）按2×106的数量注射到小鼠肩胛背部皮下。每周2次,共3周,用小动物成像仪器检测移植瘤的生物发光强度,用免疫组织化学染色实验检测不同处理下裸鼠移植瘤中Ki-67的表达情况,评价hsa_circ₀054284对裸鼠移植瘤的影响。9.用qRT-PCR方法检测不同处理组的瘤体中hsa_circ₀054284的表达情况。结果1.hsa_circ₀054284在NSCLC组织和细胞中存在,该环状RNA全长375bp,由MTA3基因13号外显子及14号外显子部分序列形成。2.与癌旁组织相比,hsa_circ₀054284在NSCLC组织低表达,与正常支气管上皮细胞（NHBE）相比,其也是低表达（P<0.05）3.CCK-8结果显示上调hsa_circ₀054284,circ-EX组细胞OD值显著下降,表明上调hsa_circ₀054284可抑制A549和H520细胞的增殖能力。4.Transwell结果显示上调hsa_circ₀054284,circ-EX组细胞穿膜细胞数少,表明上调hsa_circ₀054284可抑制A549和H520细胞的侵袭能力。5.流式细胞术显示circ-EX组细胞凋亡率（29-42%）显著高于circ-NC组细胞凋亡率（9-17%）（P<0.05）,结果表明上调hsa_circ₀054284能够促进A549和H520细胞的凋亡能力。6.裸鼠移植瘤结果显示circ-EX组移植瘤生物发光强度显著降低（P<0.05）,免疫组织化学染色实验显示各组细胞中Ki-67的表达量结果与移植瘤生物发光强度检测结果一致,表明上调hsa circ₀054284能够在一定程度上抑制裸鼠瘤体生长。第二部分hsa circ 0054284作用机制初步研究方法1.生物信息学分析hsa_circ₀054284序列,预测相关miRNA。2.双荧素酶报告实验证实hsa_circ₀054284与miR-18a-3p可以相互作用。3.用Pearson相关性分析,探索30例组织样本中miR-18a-3p和hsa_circ₀054284表达水平的相互关系。4.用 qRT-PCR 方法检测上调 hsa_circ₀054284,NSCLC 细胞 A549 和 H520中miR-18a-3p的表达水平。5.合成 miR-18a-3p Inhibitor（miR-Inhibitor）及无关序列（miR-NC）,用脂质体LipofectamineTM2000转染A549和H520细胞中,qRT-PCR检测各组细胞中miR-18a-3p的表达水平。6.探究下调miR-18a-3p对NSCLC细胞增殖、侵袭和凋亡的影响:CCK-8检测增殖能力,Transwell检测侵袭能力,流式细胞术检测凋亡能力。7.生信分析预测miR-18a-3p的靶基因。设计Overlap引物,用PCR扩增野生型及突变型靶基因,构建重组报告质粒,用双荧光素酶报告实验验证TIMP2是否是miR-18a-3p的作用靶点。用Western blot检测TIMP2蛋白的表达情况。8.Transwell回复实验,合成si-TIMP2,设计不同的组处理A549和H520细胞,用Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力。9.用SPSS 25.0软件对各实验结果数据进行统计学分析,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果1.生物信息学分析hsa_circ₀054284与miR-18a-3p存在相互作用的互补结合区。2.双荧素酶报告实验显显 miR-18a-3p mimic 与 pmirGLO-Wt circ₀054284组的荧光素酶活性显著低于其它三组（P<0.05）。表明hsa_circ₀054284可作用于互补结合区调控miR-18a-3p的表达。3.Pearson 分析结果显示,hsa_circ₀054284 和 miR-18a-3p mRNA 的表达量呈负相关关系（R2=0.431,P<0.05）。4.qRT-PCR结果显示,在NSCLC细胞中hsa_circ₀054284过表达会使miR-18a-3p 表达降低（P<0.05）。5.CCK-8结果显示miR-Inhibitor组的OD值显著低于其余两组,表明下调miR-18a-3p可抑制A549和H520细胞的增殖能力。6.Transwell结果显示下调miR-18a-3p,miR-Inhibitor组细胞穿膜细胞数少,表明下调miR-18a-3p可抑制A549和H520细胞的侵袭能力。7.流式细胞术显示miR-Inhibitor组细胞凋亡率（24-33%）显著高于miR-NC 组细胞凋亡率（11-18%）（P<0.05）,结果表明下调 miR-18a-3p 可促进 A549和H520细胞的凋亡能力。8.生信分析miR-18a-3p与靶基因TIMP2存在3个相互作用的互补结合区。9.双荧光素酶报告实验显示miR-18a-3p与TIMP2前两个互补结合区作用显著,与第三个互补结合区作用无统计学差异,miR-18a-3p mimic与pmirGLO-Wt1/2组的荧光素酶活性显著低于其它组（P<0.05）。表明miR-18a-3p可通过作用于前两个互补结合区调控TIMP2的表达。10.Western blot结果显示,在用miR-18a-3p mimic处理时,TIMP2蛋白的表达量显著下降（P<0.05）;而转染miR-18a-3p Inhibitor时,TIMP2蛋白的表达量显著高于用miR-NC组（P<0.05）。结果表明,下调miR-18a-3p表达可上调TIMP2蛋白表达。11.Transwell回复实验结果显示,用circ-EX单独处理细胞可显著抑制侵袭能力,但circ-EX与si-TIMP2共转染后没有circ-EX单独处理细胞抑制侵袭能力强（P<0.05）。结果表明,回复实验中si-TIMP2可部分削弱了 circ-EX对靶基因的影响。结论1.在NSCLC组织和细胞中发现hsa_circ₀054284存在且低表达,该环状RNA 全长 375bp。2.上调hsa_circ₀054284可抑制NSCLC细胞增殖、侵袭,促进凋亡。下调miR-18a-3p可抑制NSCLC细胞增殖、侵袭,促进凋亡。3.hsa_circ₀054284/miR-18a-3p/TIMP2 轴可能是 hsa_circ₀054284 调控NSCLC机制之一。4.hsa_circ₀054284起到抑癌作用,可能会成为新的治疗靶点。