水牛在亚洲有着7000多年的饲养历史，在中国的畜牧业生产中有着重要的经济地位。然而，由于其静态发情、妊娠期长等生物学特点而导致水牛整体的繁殖力水平低下，使得水牛养殖业的发展速度缓慢。本研究围绕如何提高水牛繁殖力这一目标，以自然突变高繁殖绵羊为线索，以最新的基因改造工具——TALEN和Cas9/gRNA为主要手段，来研究水牛卵泡发生过程中的部分基因分子机制，并对基因敲除小鼠模型制备及基因敲除水牛生产方法进行初步探讨。　　1、水牛卵泡发生相关基因的克隆与生物信息学分析　　应用RT-PCR技术成功克隆得到BMP15，GDF9，ALK3等27个水牛卵泡发生相关基因(包含全长CDS），包括:BMP15，GDF9，ALK3，ALK5，ALK6，FOXO3, Follistatin, RAD51, RAD52, CX37, WNT4, PTEN, NGF, FGF7, FGF2,FGF2R, C-KIT,KIT,GDNF,BMP6,BMP7,NOBOX,CTGF,AMH,LIF,FOXL2和PDGFA。其基因编码区的长度从468 bp到2922 bp不等，经比对分析，所克隆的基因与其他物种均具有较高的保守性，此外还对所克隆的基因的蛋白进行了系列生物信息学分析、预测。　　2、水牛卵泡发生相关基因表达规律研究　　应用QRT-PCR和免疫组化技术对所克隆基因在水牛不同组织中的表达模式进行了研究，发现ALK3，AMH，BMP6，CTGF，CX37，CX43和FGF7在所检测的组织中均有表达。其中ALK3，ALK5，ALK6，C-KIT，CTGF，CX37，CX43，FOXL2和GDF11在卵巢中相对表达量最高，NOBOX特异性的表达于卵巢中。在睾丸中相对表达量最高为BMP2;在垂体中相对表达量最高的有BMP15，FGF7; AMH在胎水牛的生殖脊中相对表达量最高。对BMP15和GDF9的深入研究表明，在卵泡发生过程中BMP15和GDF9主要表达于腔前卵泡阶段，在胚胎发生过程BMP15和GDF9主要表达于发育早期，且胚早期胎阶段相对表达量远远高于卵泡发生阶段，在囊胚阶段相对表达量降到最低。此外，相同阶段BMP15的表达量约为GDF9的2倍。免疫组化的结果表明BMP15和GDF9主要定位于腔前卵泡的卵母细胞、颗粒细胞与卵丘细胞。　　3、水牛BMP15，GDF9及BMP6相关受体的研究　　通过BiFC技术研究了水牛BMP15，GDF9，BMP6及其受体间的相互作用关系。结果表明，在293T细胞内，BMP15的Ⅰ型受体有ALK6，ALK3和ALK5，其中与ALK6的亲和力最强，BMP15既能形成同源二聚体，也能与GDF9形成异源二聚体。水牛GDF9和BMP6的Ⅰ型受体亦均为ALK6，与ALK3和ALK5均未检测到相互作用信号。为一步探讨其相互作用的机制，参考绵羊ALK6基因自然突变造成多胎的FecB模型，本研究又成功制备了水牛源ALK6基因的FecB突变小鼠模型，为深入研究FecB突变致多胎的分子机制奠定了基础。　　4、BMP15和FOXO3基因的TALEN敲除研究　　根据同源比对水牛与黄牛、绵羊、山羊、小鼠等物种的BMP15，FOXO3基因序列，选择保守区序列BMP15基因共设计3对TALENs(Btln1，2和3)，其中Btln1可用于牛和水牛的基因敲除，Btln2和3则能用于猪、牛和水牛的基因打靶。对FOXO3基因设计了一对TALENs(Ftln1)，可同时用于水牛、牛、猪和小鼠的基因敲除。用TALEN载体与报告载体pSSA-LUC，RGS共转染293T细胞，48h后在荧光显微镜下观察荧光以分析打靶效率。其中Btln1的效率荧光素酶系统检测为40％，Btln2通过Rgs系统检测的效率非常低，Btln3的效率通过Rgs系统检测对水牛有效，但对猪的效率几乎为0，Ftln1打靶效率经荧光素酶系统检测为31.3％。应用体外转录的mRNA，胞质注射入水牛、猪、FVB小鼠的受精卵后，发现Btln1注射水牛受精卵没有发生突变，Ftln1注射猪卵母细胞进行孤雌激活或的孤雌激活胚也没有发生突变，Ftln1注射FVB小鼠受精卵有突变发生。我们将体外转录的Ftln1 mRNA注射小鼠受精卵并移植，测序鉴定发现获得的20只F0代小鼠中有7只小鼠发生了FOXO3的缺失突变，突变小鼠均可正常发育至性成熟且可以繁殖出后代，突变对小鼠卵泡发生过程的影响仍在细胞和分子水平做进一步的检测。　　5、BMP15和FOXO3基因的Cas9/gRNA敲除研究　　根据已克隆测序的水牛BMP15，FOXO3序列及NCBI已公布的黄牛、绵羊、山羊、小鼠等物种的相关序列，进行同源比对，基于同源性与预期效率及位置的考虑，BMP15共设计5条gRNAs(Bcas1，2，3，4，5)序列，其中1，2两条序列可用于牛、水牛、猪及小鼠的基因敲除，3，4和5三条序列则可仅用于小鼠、牛、水牛的打靶;FOXO3设计了6条gRNAs(Fcas1，2，3，4，5，6)序列，均可以用于水牛、牛、猪及小鼠的基因敲除。应用Cas9载体与报告载体Rgs共转染293T细胞，48h后在荧光显微镜观察荧光及分析打靶效率，发现Bcas1，Bcas5，Fcas1和Fcas5对水牛、小鼠均有较高的打靶效率。制备体外转录的Cas9，Bcas1和Bcas5的mRNA混合液，胞质注射入水牛、猪、FVB小鼠、昆明小白鼠的受精卵，水牛、小鼠受精卵均有突变体产生，其中160枚小鼠胚胎中有17枚胚胎产生700多bp的长片段缺失，有30枚胚胎产生小片段的缺失，即有且仅有一条gRNA发生作用，总突变率达到29.38％。将体外转录的Bcas1，Bcas5，Fcas1和Cas9mRNA混合液注射小鼠受精卵并移植，鉴定发现获得的44只F0代小鼠中有14只小鼠发生了BMP15的单等位基因的缺失突变，1只小鼠发生了FOXO3的单等位基因的缺失突变，这两基因细胞和分子水平对突变鼠卵泡发生过程的影响仍在做进一步的检测。研究结果为后期应用Cas9/gRNA进行BMP15基因敲除水牛生产奠定了基础。