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在冬季或我国北方地区,低温是影响生活污水生物处理效果不佳的主要原因。筛选分离在低温下活性相对较高的菌株,形成以冷适应微生物为优势菌群的活性污泥,是解决低温生活污水问题的根本方法。本课题将对象确定为生活污水中具体的有机物,对能够分泌蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的耐冷菌展开系列研究,并深入低温酶领域,为酶学工程做贡献。(1)从大庆油田土壤这一非极端自然环境中,经过低温富集,平板初筛,温度复筛和酶活力检测等方法分离筛选耐冷细菌。土壤样品中几乎无淀粉酶或果胶酶的高产耐冷细菌,主要获得两株产蛋白酶能力较佳的耐冷细菌,假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的狭义耐冷菌LS3和微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)的广义耐冷菌LS4。(2)两株菌在低温下均能够良好生长及产酶,但产酶特性受环境中碳源和氮源影响较大:均不能利用葡萄糖、麦芽糖或可溶性淀粉;众多氮源中,LS4只能利用酪素,其所产酶应为诱导酶;在尿素培养基中,LS3产酶酶活达到52.46U/mL。该生理生长及产酶特性的研究,为耐冷菌的应用提供了有力支撑。(3)利用海藻酸钙包埋法固定耐冷菌,在不借助造粒器等设备的条件下,成功制备微米级尺寸的凝胶微球,且微球包埋下的耐冷菌仍能较好地生长及产酶,只是仅利用单一海藻酸钙进行包埋,并不能显著提高细菌的抗逆性。(4)利用硫酸铵分级沉淀法分离提取LS3和LS4两株菌所产胞外蛋白酶,并进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)表征。LS3菌株在尿素存在时分泌更多胞外酶,这也许是LS3菌株能更好地利用尿素产蛋白酶的原因,其至少分泌一种大小在50 KDa左右的胞外蛋白酶。LS4菌株似乎在酪素培养基中可产三种蛋白酶。(5)LS3和LS4两菌株所产酶的最适作用温度分别为40℃和30℃左右,最适作用pH为8左右,低温碱性环境中蛋白酶均维持较高活性,而热稳定性差,均为低温碱性蛋白酶。金属离子对LS3菌株产蛋白酶的酶活有一定程度的抑制作用,乙二胺四乙酸(EDTA)对其几乎无影响,而LS4菌株所产蛋白酶对EDTA敏感,属于金属蛋白酶。吐温80作为稳定剂,对两蛋白酶均有一定激活作用。该研究对蛋白酶的实际应用具有指导性意义。目前有关冷适应微生物的分离研究,主要集中在海洋、极地、冰川、高山冻土等极端环境,而本课题菌株筛选样品采集于大庆油田这一非极端自然环境中,为选育应用于环境、工农业生产等领域的耐冷菌积累了微生物资源,并为冷适应机制和低温酶的研究提供参考数据。