研究背景与目的:肝脏疾病是一个全球性的重大问题,中国约有三亿人罹患肝脏相关疾病。虽然自1992年以来疫苗接种降低了感染病毒性肝炎的人数,但是非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率却迅速升高。NAFLD从单纯性脂肪性肝病可以进展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至是肝癌。肝癌是全球最致命的癌症之一,在中国发病率排第二,5年病死率更是超过90%,在NAFLD早期对肝脏疾病进行干预和治疗显得尤为重要。NAFLD在单纯性脂肪性肝病阶段的病理特征是肝实质细胞的脂滴(lipid droplets,LDs)中性脂特异性增多,目前已有关于NAFLD患者肝组织和正常肝组织的脂滴比较蛋白质组学研究,并发现了可能引起NAFLD的脂滴蛋白。事实上,正常的肝脏实质细胞内就存在大小不一的脂滴,NAFLD的发生是肝实质细胞内原有大脂滴数量增多还是脂滴的病理性改变尚不明确。为了回答这个问题,我们首先应该了解生理状态下肝实质细胞内大小脂滴各自的特征。肝纤维化发生过程中,肝星状细胞(hepaticstellate cells,HSCs)激活转化为肌成纤维细胞,产生大量的细胞外基质,是肝纤维化形成的中心环节。肝星状细胞活化的主要特征是含有特殊中性脂——视黄醇酯(retinolesters,REs)的脂滴大量减少。目前对于肝星状细胞的脂滴和活化之间的因果关系尚不清楚。肝星状细胞的脂滴脂质组学和蛋白组学研究也不完善。虽然现今已发现某些脂滴蛋白与肝星状细胞活化的调控相关。但脂滴的动态变化与调控肝星状细胞活化的关系,以及相关机制仍不清楚。本学位论文运用我们实验室建立的脂滴纯化及大小脂滴分离技术,辅以高通量手段,分离纯化了 C57/BL6小鼠肝实质细胞的大小脂滴,并对它们的脂质和脂滴蛋白组成进行比较组学分析。对认识理解生理状态下不同尺寸脂滴各自的特点,更好地分析NAFLD大脂滴的产生原因,揭示NAFLD的发病机制提供了研究基础和线索。另外,我们还分离纯化了小鼠原代肝星状细胞,探索了其活化的调控及脂滴蛋白的变化。同时,我们纯化了肝星状细胞人源细胞株LX-2的脂滴,并对其脂滴蛋白进行组学分析。我们进一步比较逆转活化前后肝星状细胞脂滴的脂滴蛋白组变化,发现了一些可能参与肝星状细胞活化的脂滴蛋白。研究方法:第一部分研究中,为了分析小鼠肝脏实质细胞中不同脂滴的脂质组成,选取24周龄雄性C57/BL6小鼠,原位逆行灌注和体外消化方法从小鼠肝脏中分离出肝实质细胞,匀浆器研磨破碎,然后通过差速离心的方法分离出尺寸不同的脂滴。脂滴经LipidTOX染色,共聚焦荧光显微镜观察脂滴形态,并用动态光散射仪测量脂滴的尺寸。采用薄层层析色谱(TLC)检测不同大小脂滴的中性脂组成。利用银染和Western blot初步分析不同大小脂滴的蛋白质组成。最后用高通量方法对脂滴脂质成分差异较大的两个组分进行半定量蛋白质组学分析。第二部分研究中,为了分析小鼠肝脏肝星状细胞脂滴与活化的关系,原位逆行灌注和体外消化方法分离出C57/BL6小鼠肝实质细胞后,剩下的为肝脏间质细胞,然后通过密度梯度离心分选出原代肝肝星状细胞。原代肝星状细胞的脂滴蛋白Perilipin-2(PLIN2)和Perilipin-3(PLIN3)用免疫荧光法观测在脂滴上的定位。提取后的肝星状细胞体外培养可以模拟肝脏受到病理刺激时肝星状细胞激活、增值、转化为肌成纤维细胞的过程。分别用retinol 10 μM和OA 100μ M处理原代肝星状细胞和LX-2细胞株,观察脂滴尺寸、数量和中性脂(甘油三酯/视黄醇酯)成分的改变,检测肝星状细胞活化指标如α-SMA、fibronectin等的改变。因为原代肝星状细胞数量有限,不足以提取足够量的脂滴做蛋白质组分析,我们从20个150*20 mm细胞培养皿中成功地分离纯化出LX-2细胞的脂滴,用共聚焦荧光显微镜和动态光散射仪观测脂滴,用银染和Western blot对脂滴蛋白进行初步分析,确定脂滴提取的纯度和其它细胞器之间的关系。脂滴蛋白在SDS-PAGE的主要条带进行胶内酶解和质谱分析,分析LX-2的脂滴主要蛋白。脂滴全蛋白用鸟枪法质谱鉴定,并进行功能分类。Retinol和OA处理LX-2细胞,提取的脂滴和Control比较,做质谱半定量分析,分析LX-2细胞活化逆转前后脂滴蛋白的变化。研究结果:第一部分研究发现,肝实质细胞的脂滴尺寸在200nm～3000nm范围,不同大小的脂滴含有不同的中性脂成分,其中尺寸大的脂滴胆固醇酯含量更高,而尺寸小的脂滴甘油三酯含量更高。银染和Westernblot结果显示,不同大小脂滴的蛋白组成也有差异,小脂滴和内质网、线粒体的关系更为密切。最后用质谱半定量方法将中性脂成分差异较大的两种脂滴进行比较蛋白质组学分析,发现在肝实质细胞中,富含胆固醇酯的脂滴比富含甘油三酯的脂滴具有更多代谢相关的酶。第二部分研究发现,retinol和OA处理可以使原代肝星状细胞和LX-2细胞的脂滴增多增大,retinol主要增加视黄醇酯(retinol esters,REs)的含量,OA主要增加甘油三酯(TAG)的含量;retinol和OA都可以抑制原代肝星状细胞的活化进程,也可以逆转完全活化的 LX-2 细胞。PLIN3、3 beta-hydroxy steroid dehydrogenase type 7(3-β-HSD7)、7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 17(7-β-HSD17)和retinol dehydrogenase 14(RDH14)是新发现的肝星状细胞的脂滴主要蛋白。经OA处理后,LX-2的脂滴蛋白数量显著减少。根据脂滴蛋白对retinol和OA的反应,我们把 465 个蛋白分在 11 个组中,其中 PLIN3 和 autophagy-related protein 2 homolog A(Atg2A)可能参与调控肝星状细胞的活化。由此,我们建立了一个完整的肝星状细胞脂滴蛋白资料库,发现多个可能参与星状细胞活化的脂滴蛋白,为研究脂滴和肝星状细胞活化相关性提供依据。研究结论:正常肝实质细胞内脂滴尺寸在200 nm～3000 nm范围,尺寸大的脂滴胆固醇酯含量更高,而尺寸小的脂滴主要含甘油三酯。并且尺寸小的脂滴和内质网、线粒体的关系更为密切。富含胆固醇酯的脂滴行使更多的胆固醇代谢功能,而富含甘油三酯的脂滴可能更多的作为甘油三酯储存的细胞器。肝星状细胞的脂滴和其活化具有相关性,维持肝星状细胞脂滴的中性脂含量,无论是增加视黄醇酯还是甘油三酯的量,都可以抑制肝星状细胞的活化。我们建立了一个完整的和肝星状细胞活化相关的脂滴蛋白资料库,其中PLIN3和Atg2A蛋白有可能参与调控肝星状细胞的活化。