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脑卒中是目前致残率第一、致死率第三的神经疾病，但是脑卒中神经元死亡的分子机制并不完全清楚。本论文具体研究内容如下：
(1)论文第2章提取局部脑缺血3h的小鼠脑匀浆，与对照组小鼠脑匀浆做SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，在蛋白分子大小48kDa左右，缺血组蛋白条带与对照组蛋白条带相比较明显减弱，结合质谱分析仪对切下来的特异条带进行质谱分析，Enolase1(ENO1)蛋白在缺血组相比较对照组显著降低。为进一步验证ENO1在脑缺血过程中的变化，构建脑缺血1-3h的小鼠，提取缺血区域脑匀浆用ENO1抗体进行免疫印迹杂交，在缺血早期1h，ENO1蛋白表达水平明显上调，在脑缺血2-3h，ENO1蛋白表达水平逐渐下调，在缺血3h时间点，ENO1蛋白相对于对照组蛋白下降了50%左右。ENO家族有4个基因成员，提取成年C57小鼠脑、肾及肝的mRNA，反转录为CDNA，针对ENO1-4成员基因设计引物进行PCR扩增，数据显示ENO1在脑、肾及肝等组织广泛表达。为鉴定ENO1在小鼠脑不同区域及不同发育阶段的表达模式，提取成年C57小鼠的溴球、皮层、海马、脑干和小脑的mRNA和蛋白质，分别用RT-PCR和免疫印迹检测，ENO1在脑的溴球、皮层、海马、脑干和小脑都表达。提取0天、7天、14天、28天、56天小鼠的mRNA和蛋白质，用RT-PCR和免疫印迹检测，ENO1在小鼠脑发育过程中表达水平逐渐升高。小鼠脑除了神经元还有胶质细胞等其他类型细胞，为鉴定ENO1在神经元中的表达及定位，原代培养的海马神经元培养至第14天提取总蛋白质，用ENO1抗体进行免疫印迹，数据显示ENO1蛋白在神经元中表达，同时培养的海马神经元第10天，磷酸钙转染GFP质粒标记神经元，第14天用ENO1抗体免疫染色，数据表明ENO1定位神经元胞体及树突。
(2)论文第3章为体外验证ENO1蛋白在脑缺血中发挥的功能，原代培养的海马神经元进行缺氧缺糖刺激(Oxgen-Glucose Deprivation，OGD)，在细胞水平模拟脑卒中。原代培养的小鼠海马神经元第14天缺氧缺糖处理1-3h，提取蛋白质用ENO1抗体进行免疫印迹，在海马神经元缺氧缺糖刺激1h或2h，ENO1蛋白表达水平上调，在海马神经元缺氧缺糖刺激3h，ENO1蛋白表达水平下调，体外数据显示ENO1呈现出动态变化，与体内数据趋势一致。为确认ENO1在缺氧缺糖刺激过程中的定位变化，海马神经元缺氧缺糖刺激2-6h后用ENO1抗体免疫染色，数据显示ENO1在缺氧缺糖刺激过程中，胞浆中的ENO1也呈现出动态变化。在神经元中过表达PLX304-ENO1-V5质粒，缺氧缺糖刺激观察过表达ENO1蛋白的神经元与对照组神经元的损伤情况，在原代培养的海马神经元第10天用磷酸钙转染GFP质粒或GFP质粒和ENO1质粒，第14天过表达GFP或过表达ENO1组均未改变神经元的形态，缺氧缺糖刺激1h或2h，对照组神经元树突的长度比过表达ENO1的神经元树突长度短，对照组神经元树突棘的密度比过表达ENO1的神经元树突棘密度更低，这些数据显示，在缺氧缺糖进程中ENO1缓解神经元树突及树突棘损伤。ENO1催化产物PEP含量在小鼠脑缺血模型中呈现动态变化。培养的海马神经元添加PEP化学物质可缓解缺氧缺糖神经元损伤，立体注射PEP化学物质可降低脑缺血导致的神经元死亡。ENO1基因敲除的秀丽隐杆线虫缺氧饥饿存活率与野生型N2线虫缺氧饥饿存活率相比较没有差异。
(3)论文第4章构建小鼠局部脑缺血2h，对海马组织进行蛋白质组学和磷酸化组学分析，蛋白质组学鉴定28个蛋白发生显著性表达水平变化，磷酸化组学鉴定873个肽段磷酸化修饰显著变化，磷酸化修饰上调为135个蛋白的184个肽段，磷酸化修饰下调为420个蛋白的689个肽段。转录组学鉴定415个基因显著上调，222个基因显著下调。磷酸化组学数据进行KEGG信号通路分析，主要富集在谷氨酸突触、多巴胺突触、胞吞和突触囊泡循环。突触前囊泡调控关键蛋白synaptotagmin-1(syt1)的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。
(4)论文第5章用核酸适体筛选脑缺血标记蛋白，构建脑缺血早期4h小鼠模型，以缺血同侧脑片为阳性筛选脑片，以脑缺血对侧脑片为阴性筛选脑片，经过十轮筛选富集，鉴定得到核酸适体LCW17可以稳定结合脑缺血同侧脑片。
(5)论文第6章用核酸适体LCW17与脑匀浆免疫共沉淀、考马斯亮蓝染色和质谱分析，核酸适体LCW17的靶蛋白是Vigilin蛋白，核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his直接相互作用，亲和力分析实验显示核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his的结合Kd数值为25nM左右。构建脑缺血早期梯度时间点，脑缺血时间越长，核酸适体LCW17结合脑缺血同侧脑片的数量越多，核酸适体LCW17可以用于评估脑缺血程度。原代培养的海马神经元缺氧缺糖处理，随着缺氧缺糖时间的增加，神经元分泌的Vigilin蛋白增多。立体注射核酸适体LCW17到脑缺血脑内，核酸适体LCW17在脑缺血同侧结合能力显著高于脑缺血对侧，核酸适体LCW17可以进行小鼠脑缺血体内应用。
综上，本论文用小鼠构建脑缺血动物模型，蛋白质组学鉴定ENO1蛋白参与脑缺血进程，用脑卒中体外细胞模型系统，发现ENO1在缺氧缺糖的病理发生过程中，降低神经元树突及树突棘损伤，从而为理解和治疗脑卒中疾病提供了一种新的途径。磷酸化组学鉴定突触前囊泡调控关键蛋白syt1的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。基于缺血脑切片的核酸适配体筛选技术能够有效用于脑缺血疾病靶标与探针的发现，核酸适配体LCW17和Vigilin蛋白对于脑卒中疾病发生机制的研究以及疾病的诊断具有重要的意义。
(1)论文第2章提取局部脑缺血3h的小鼠脑匀浆，与对照组小鼠脑匀浆做SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，在蛋白分子大小48kDa左右，缺血组蛋白条带与对照组蛋白条带相比较明显减弱，结合质谱分析仪对切下来的特异条带进行质谱分析，Enolase1(ENO1)蛋白在缺血组相比较对照组显著降低。为进一步验证ENO1在脑缺血过程中的变化，构建脑缺血1-3h的小鼠，提取缺血区域脑匀浆用ENO1抗体进行免疫印迹杂交，在缺血早期1h，ENO1蛋白表达水平明显上调，在脑缺血2-3h，ENO1蛋白表达水平逐渐下调，在缺血3h时间点，ENO1蛋白相对于对照组蛋白下降了50%左右。ENO家族有4个基因成员，提取成年C57小鼠脑、肾及肝的mRNA，反转录为CDNA，针对ENO1-4成员基因设计引物进行PCR扩增，数据显示ENO1在脑、肾及肝等组织广泛表达。为鉴定ENO1在小鼠脑不同区域及不同发育阶段的表达模式，提取成年C57小鼠的溴球、皮层、海马、脑干和小脑的mRNA和蛋白质，分别用RT-PCR和免疫印迹检测，ENO1在脑的溴球、皮层、海马、脑干和小脑都表达。提取0天、7天、14天、28天、56天小鼠的mRNA和蛋白质，用RT-PCR和免疫印迹检测，ENO1在小鼠脑发育过程中表达水平逐渐升高。小鼠脑除了神经元还有胶质细胞等其他类型细胞，为鉴定ENO1在神经元中的表达及定位，原代培养的海马神经元培养至第14天提取总蛋白质，用ENO1抗体进行免疫印迹，数据显示ENO1蛋白在神经元中表达，同时培养的海马神经元第10天，磷酸钙转染GFP质粒标记神经元，第14天用ENO1抗体免疫染色，数据表明ENO1定位神经元胞体及树突。
(2)论文第3章为体外验证ENO1蛋白在脑缺血中发挥的功能，原代培养的海马神经元进行缺氧缺糖刺激(Oxgen-Glucose Deprivation，OGD)，在细胞水平模拟脑卒中。原代培养的小鼠海马神经元第14天缺氧缺糖处理1-3h，提取蛋白质用ENO1抗体进行免疫印迹，在海马神经元缺氧缺糖刺激1h或2h，ENO1蛋白表达水平上调，在海马神经元缺氧缺糖刺激3h，ENO1蛋白表达水平下调，体外数据显示ENO1呈现出动态变化，与体内数据趋势一致。为确认ENO1在缺氧缺糖刺激过程中的定位变化，海马神经元缺氧缺糖刺激2-6h后用ENO1抗体免疫染色，数据显示ENO1在缺氧缺糖刺激过程中，胞浆中的ENO1也呈现出动态变化。在神经元中过表达PLX304-ENO1-V5质粒，缺氧缺糖刺激观察过表达ENO1蛋白的神经元与对照组神经元的损伤情况，在原代培养的海马神经元第10天用磷酸钙转染GFP质粒或GFP质粒和ENO1质粒，第14天过表达GFP或过表达ENO1组均未改变神经元的形态，缺氧缺糖刺激1h或2h，对照组神经元树突的长度比过表达ENO1的神经元树突长度短，对照组神经元树突棘的密度比过表达ENO1的神经元树突棘密度更低，这些数据显示，在缺氧缺糖进程中ENO1缓解神经元树突及树突棘损伤。ENO1催化产物PEP含量在小鼠脑缺血模型中呈现动态变化。培养的海马神经元添加PEP化学物质可缓解缺氧缺糖神经元损伤，立体注射PEP化学物质可降低脑缺血导致的神经元死亡。ENO1基因敲除的秀丽隐杆线虫缺氧饥饿存活率与野生型N2线虫缺氧饥饿存活率相比较没有差异。
(3)论文第4章构建小鼠局部脑缺血2h，对海马组织进行蛋白质组学和磷酸化组学分析，蛋白质组学鉴定28个蛋白发生显著性表达水平变化，磷酸化组学鉴定873个肽段磷酸化修饰显著变化，磷酸化修饰上调为135个蛋白的184个肽段，磷酸化修饰下调为420个蛋白的689个肽段。转录组学鉴定415个基因显著上调，222个基因显著下调。磷酸化组学数据进行KEGG信号通路分析，主要富集在谷氨酸突触、多巴胺突触、胞吞和突触囊泡循环。突触前囊泡调控关键蛋白synaptotagmin-1(syt1)的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。
(4)论文第5章用核酸适体筛选脑缺血标记蛋白，构建脑缺血早期4h小鼠模型，以缺血同侧脑片为阳性筛选脑片，以脑缺血对侧脑片为阴性筛选脑片，经过十轮筛选富集，鉴定得到核酸适体LCW17可以稳定结合脑缺血同侧脑片。
(5)论文第6章用核酸适体LCW17与脑匀浆免疫共沉淀、考马斯亮蓝染色和质谱分析，核酸适体LCW17的靶蛋白是Vigilin蛋白，核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his直接相互作用，亲和力分析实验显示核酸适体LCW17与重组蛋白Vigilin-his的结合Kd数值为25nM左右。构建脑缺血早期梯度时间点，脑缺血时间越长，核酸适体LCW17结合脑缺血同侧脑片的数量越多，核酸适体LCW17可以用于评估脑缺血程度。原代培养的海马神经元缺氧缺糖处理，随着缺氧缺糖时间的增加，神经元分泌的Vigilin蛋白增多。立体注射核酸适体LCW17到脑缺血脑内，核酸适体LCW17在脑缺血同侧结合能力显著高于脑缺血对侧，核酸适体LCW17可以进行小鼠脑缺血体内应用。
综上，本论文用小鼠构建脑缺血动物模型，蛋白质组学鉴定ENO1蛋白参与脑缺血进程，用脑卒中体外细胞模型系统，发现ENO1在缺氧缺糖的病理发生过程中，降低神经元树突及树突棘损伤，从而为理解和治疗脑卒中疾病提供了一种新的途径。磷酸化组学鉴定突触前囊泡调控关键蛋白syt1的T112位点磷酸化修饰促进神经元缺氧缺糖损伤。小鼠syt1的秀丽隐杆线虫同源蛋白SNT-1缺失突变体表现出缺氧饥饿耐受性。基于缺血脑切片的核酸适配体筛选技术能够有效用于脑缺血疾病靶标与探针的发现，核酸适配体LCW17和Vigilin蛋白对于脑卒中疾病发生机制的研究以及疾病的诊断具有重要的意义。