一、研究目的:在学习记忆的过程中,新的牢固记忆的形成有赖于学习后短时记忆向长时记忆过渡的一段稳定的过程,此过程称之为“整合”(consolidation)。然而当与先前的记忆相同或是相似条件刺激(conditioned stimulus,CS)再次出现时,经过整合后的记忆会被再次激活,并进入一过性不稳定的状态,这一过程称之为“再整合”(reconsolidation)。当记忆进入再整合过程后,根据条件的不同结局也会不同:如果再次出现相同的非条件刺激(unconditioned stimulus,US),则使原有记忆更加稳定；如果没有出现US,则可能进入消退过程,表现为原有记忆强度的减弱,因此,再整合在长时记忆形成的生理过程中至关重要。随着研究的深入,再整合过程的研究已经大幅扩展到众多学习记忆的系统模型和流程中,并发现了不同于其他记忆过程的特点:首先,再整合中涉及的神经环路及分子与整合过程有所不同；其次,阻断再整合并不能让记忆转向消退过程；再次,再整合的机制倾向于信息更新说,如果新信息与原有记忆获得时的信息不同,则会导致以前整合的记忆发生改变；最后,再整合在一定条件下才能被干预。这些特有的性质决定了再整合过程的特殊性。了解参与该过程的分子机制对深入认识再整合的本质,为将来进行相关临床记忆障碍疾病的有效干预提供借鉴。　　 在学习记忆的研究中,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophicfactor,BDNF)是其中的重要分子之一,它不仅可以维持胚胎期神经元的存活和分化、突起生长、联系和可塑性,而且进一步的证据表明,BDNF也参与了其他多项高级神经功能,如认知、情绪、精神、思维、学习记忆等。BDNF能够与在神经细胞上高亲和力的酪氨酸蛋白激酶B(Tyrosine kinase,TrkB)受体特异性结合,激发各种信号传导通路而发挥其特殊的生物作用。目前的研究表明,BDNF参与了多种记忆的调控,并在不同脑区不同过程发挥不同作用:在海马学习记忆研究中,Morris水迷宫检测发现成年BDNF基因缺失突变小鼠空间记忆的获得明显减弱；在条件性位置偏好实验中,BDNF通过促进长时程增强(long-termpotentiation,LTP),对记忆的整合作用起重要作用；另有文献证实海马中BDNF表达在环境依赖性恐惧记忆中的获得,整合中发挥作用,而阻断海马BDNF功能则可能妨碍已获得记忆的消退。而杏仁体中央核(central nuclei of amygdala,CeA)及杏仁体基底外侧核(basolateral nuclei of amygdala,BLA)在条件性恐惧记忆的获得,整合及消退过程中的作用不同,阻断CeA脑区BDNF合成可以抑制恐惧记忆的获得及整合。此外,有资料显示BDNF通过前额叶(prefrontal cortex,PFC)及其亚核团(缘前叶,边缘前皮质)在条件性恐惧记忆的整合,消退的调控中发挥不同作用。上述研究表明,BDNF广泛参与了各种学习记忆模型,并且在不同脑区调控记忆的不同过程,发挥重要作用；但是BDNF在再整合过程中是否发挥作用,有无时空作用的特异性尚不清楚。　　 条件性味觉厌恶(conditioned taste aversion,CTA)是厌恶性联合学习模型的一种,是通过将一种新奇味觉刺激与腹部不适感相偶联而获得记忆的模型。这一模型有较多优点,它可以通过一次学习获得,并且记忆保持时间长久,操作相对简单,所以是研究厌恶性联合学习记忆的较好模型。已有的报道证实,在CTA模型中,阻断大鼠岛叶皮层(insular cortex,IC)的蛋白合成能够影响记忆的整合及再整合过程,而且有文献证明阻断杏仁体脑区新蛋白合成后,对CTA记忆的再整合过程并无影响,但是BDNF是在其中变化情况及作用尚不明确。所以本项研究主要通过CTA模型的建立,利用实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)及脑立体定位显微注射等方法,检测再整合过程中BDNF在不同脑区的表达水平,比较与整合过程的差异,并在上述过程中施加干预因素,观察其行为学表现。　　 二、研究方法:　　 1.在基因表达水平明确BDNF在CTA再整合过程中的变化:大鼠经过CTA再整合的训练,在不同时间点(第一天测试后2 h,4 h,6 h,8 h及12h)取材,提取IC及CeA脑区的组织利用RT-PCR的方法,检测BDNF mRNA表达水平的变化,并在变化最明显的时间点的比较各组BDNF mRNA表达情况。　　 2.证实BDNF对CTA行为学的影响:利用脑内微量注射抑制剂K252a阻断Trk受体,来确定IC及CeA BDNF功能阻断后,对CTA整合及再整合过程中厌恶指数(aversion index,AI)的影响；并同时监测注射K252a后,相应脑区BDNF mRNA的变化情况。由于K252a非选择性作用于Trk受体,为进一步验证BDNF／TrkB通路作用的特异性,分别在CTA整合和再整合过程中,IC内给与BDNF的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO),并检测行为学变化。　　 3.给予外源性人工重组BDNF(human recombinant BDNF,hrBDNF)特异性纠正BDNF ASO引发的记忆缺陷:分别在CTA整合和再整合过程中,IC内微量注射ASO并注射hrBDNF对ASO阻断BDNF合成产生的行为学影响进行补救,从而证明BDNF在整合及再整合中作用的特异性。　　 三、实验结果:　　 1.RT-PCR结果显示IC的BDNF mRNA水平分别在CTA再整合后6小时及整合后4小时达到高峰,与对照组相比有显著性差异；CeA的BDNF mRNA表达在整合后4小时变化与对照组相比显著性升高,但是,再整合后6小时其表达无明显变化。　　 2.给与K252a后,在IC中再整合及整合过程与对照组相比均发生明显行为学改变；但是在CeA脑区仅在整合过程中发生行为学的明显改变；而在BDNF表达水平上,注射K252a后取材,检测并发现IC内BDNF mRNA水平在再整合及整合过程中与空白对照组相比均无差异,CeA脑区其水平在两个过程中与对照组相比也无明显差异。选择IC进一步给与BDNF ASO后,其行为学变化与注射K252a后相似。　　 3.选择IC给与BDNF ASO后,后再予以外源性hrBDNF可以纠正行为学的缺陷。　　 四、买验绪论:　　 通过从分子到整体不同水平的实验,我们证实BDNF参与了CTA记忆的再整合过程,并在IC及CeA中的作用存在差异;BDNF在CTA整合及再整合过程中的作用也存在不同。以上时、空、记忆过程中BDNF作用的差异特点,提示记忆的不同过程是由不同的神经环路通过特有的分子机制进行精密调控,这种特殊性可为将来临床记忆障碍疾病的选择性干预提供可能。