目的颈椎后纵韧带骨化症(OPLL)是以颈椎韧带异位骨化为特点的常见脊柱疾患,随着骨化的进展,椎管逐渐狭窄,脊髓和神经组织受压、损伤,可导致不同程度的内脏植物神经功能紊乱及四肢感觉、运动障碍等临床症状,甚至完全瘫痪。在亚洲人群中,特别是在年龄超过65岁的老年人群中发病率较高,可达20%~34%。OPLL目前保守治疗效果差,但外科手术治疗有时效果不理想,且手术风险较大,容易出现颈脊髓损伤等严重并发症,因此急需开发更加安全、有效的药物或其它治疗手段。自从报道OPLL以来,通过大量基础和临床方面研究,发现基因突变、细胞因子、激素及细胞内信号转录因子等与OPLL密切相关,例如BMPs、IGF等多种细胞因子及蛋白酶A/C、SMAD、MAPK通路等均在OPLL发生和发展过程起到重要作用。虽然这些研究对颈椎后纵韧带骨化的病因和发病机制有一定诠释,但仍未能清楚的解释其确切发病机制及发病机理,需更进一步探索。(1)OPLL是韧带组织异位骨化成骨组织,细胞的转化是其基本病理过程,因此探讨骨化后纵韧带内的成骨相关细胞是否具有干细胞特性有助于进一步明确其发病机制;(2)在我们前期研究中发现缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)在OPLL韧带细胞内表达明显高于非OPLL韧带细胞,并且初步提示其在OPLL发生发展过程中可能起到非常重要的作用。因此,需更深入的研究Cx43功能及其具体作用机制,阐明其与胞内相关信号传导通路的功能关系;(3)近几年研究发现与炎症相关的NF-κB/p65(p65)是成骨过程中的关键调节因子,可促进软骨的发生及成骨化,参与并协调骨再生过程。但其在颈椎后纵韧带骨化过程中相关机制尚无报道。因此,进一步深入研究p65在OPLL成骨转分化过程中的作用机制,阐明作用方式,明确OPLL的发生是否与炎症因子相关,不但有助于全面认识OPLL的发病机制,又为研究OPLL治疗及预防提供理论基础和新思路。方法自2013年12月至2014年8月对22例颈椎后纵韧带骨化症和16例非骨化颈椎病患者行颈椎前路手术,包括椎间隙减压融合内固定术或椎体次全切除减压融合内固定术,术中收集后纵韧带组织标本,切除过程中尽量减少枪状咬骨钳对所取韧带、骨化组织的钳压,并大块切除。标本分为两部分:第一部分标本切取后PBS缓冲液冲洗并立即多聚甲醛固定,随后行HE染色和免疫组织化学染色等组织学观察。第二部分标本培养韧带细胞,利用免疫荧光染色技术对细胞内波状蛋白染色并鉴定后纵韧带细胞,以及进行相关分子生物学研究。具体如下:取第3代OPLL细胞,应用流式细胞技术鉴定细胞膜表面抗原;培养细胞分别经不同诱导液诱导,检测成骨活性相关ALP染色及茜素红染色、检测成脂活性相关油红染色及成软骨活性相关阿辛蓝染色,应用Q-PCR技术检测分化相关基因(BMP2、Runx2、ALP、PPARγ2、LPL、Sox9、COL2A1、COL10A1)活性。细胞种植于裸鼠体内,并观察其在体成骨活性。取第3代两组细胞,种植于加力板内培养,采用Flexercell细胞应力加载系统对细胞施加机械应力,对照组为以同样条件培养细胞但未施加机械应力。实时荧光定量聚合酶链反应(RT Q-PCR)技术检测机械应力诱导前后成骨特异性标志基因碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(COL I)、骨钙素(OCN)及Runx2表达量的差异;制备Cx43基因干扰RNA(si RNA)序列,采用阳离子转染试剂携带si RNA转染两组细胞,以阻断Cx43基因的表达,并分别以Q-PCR技术及Western-blotting技术检验转染效率。将骨化、非骨化及转染、非转染细胞应力加载,分别加载0min、15min、30mn、60min及90min五个时间点,提取各时间点细胞总蛋白,Western-blotting技术分别检测p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p65蛋白的含量。分别选择p38 MAPK、ERK1/2、JNK及NF-κB/p65通路特异抑制剂选择合适浓度抑制各通路蛋白磷酸化,应力加载48h后分别检测ALP、COL I、Runx2及OCN等成骨标志物基因的表达。采用酶联免疫吸附试验测定(ELISA)检测炎症相关因子IL-1β、IL-6及TNF-α分泌量。结果组织经免疫组织化学染色提示在所切除韧带标本内Cx43、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、p-p65以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α均有阳性表达,OPLL组明显强于n-OPLL组。以组织块培养法培养2w左右细胞可从组织块中爬出,形状不规则,大致呈梭形,排列紊乱。培养3w后细胞单层状聚集,围绕组织块呈簇状分布,排列有序,呈多角形及纺锤形。其中骨化与非骨化组细胞形状无明显差别。免疫荧光波状蛋白染色呈阳性,细胞形态好,提示所培养细胞为后纵韧带细胞。胞膜表面抗原CD29、CD105、CD90和CD44阳性,CD34及CD45阴性,与间充质干细胞(MSCs)细胞表面特异标志物相符合。经诱导液诱导14天后,可发现有大量酯滴、钙化结节(28d)及软骨球形成,ALP染色强阳性;细胞种植于裸鼠体内2月后,可见有钙盐沉积,新生骨形成,具有较强成骨能力。Western-blotting检测提示连接蛋白Cx43在骨化组细胞内表达明显强于非骨化组,差异显著(p<0.05)。成功构建了Cx43的si RNA,分别经Q-PCR及Western-blotting检测基因及蛋白的抑制效率均大于70%以上。机械牵张应力可诱导细胞内p38 MAPK、ERK1/2、JNK及p65的磷酸化,在应力刺激30min或60min时达到磷酸化高峰,随后下降。骨化组磷酸化较非骨化组明显,差异显著,有统计学意义(p<0.05)。对Cx43基因行小RNA干扰后,再以机械应力刺激,各时间点p38 MAPK、ERK1/2、JNK及p65磷酸化水平明显减低,与未干扰组相比差异显著(p<0.05)。细胞经机械应力刺激后,成骨相关标记物ALP、COL I、OCN及Runx2基因表达明显增高,诱导前后相比差异显著(p<0.05)。而对于非骨化组细胞却无明显刺激作用。分别干扰Cx43表达及以各通路特异抑制剂抑制通路蛋白磷酸化后,再以机械应力刺激48h,ALP、COL I、OCN及Runx2基因表达较单纯机械应力刺激组减弱,差异显著(p<0.05),其中在抑制JNK通路组差异不明显(p>0.05)。提示JNK通路在OPLL发生过程中作用不显著。ELISA检测骨化组细胞培养液中的炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α在机械应力刺激后明显增多,与未刺激相比差异显著(p<0.05)。在非骨化组细胞无明显作用。干扰Cx43或抑制p65通路可明显降低机械应力刺激效应,IL-1β、IL-6及TNF-α分泌减少,差异显著,具有统计学意义(p<0.05)。结论颈椎后纵韧带细胞可通过组织块培养法成功获得,并以波状蛋白染色证实其来源。(1)细胞的表面标志物及成骨、成脂、成软骨多向分化及细胞裸鼠体内成骨能力均提示其符合间充质干细胞特性。(2)机械应力在颈椎后纵韧带骨化的病理过程中起到了重要的促进作用;(3)p38 MAPK、ERK1/2及p65通路可能参与了OPLL的骨化发生和进展过程;(4)Cx43蛋白及其相关信号传递作用参与了OPLL发展过程,其中Cx43可能通过p38-MAPK、ERK1/2及p65通路影响骨化过程;(5)通过检测标本及应力刺激后细胞培养液中炎症因子表达提示炎症因子也可能参与了OPLL的发生过程。且这些因子分泌可能和p65通路有关。