磁—温度响应聚N-异丙基丙烯酰胺基溶菌酶分子印迹复合材料的制备及吸附性能

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蛋白质的高效选择性识别和分离纯化对基因工程、生物医药、生命科学等研究极其重要,发展新型的蛋白质分离技术,研发蛋白质选择性识别材料具有重要的应用价值。溶菌酶(Lysozyme)是一种抗菌活性物质,是机体免疫防御机制的组成部分。近些年的研究表明,溶菌酶可用于急性白血病、肾小管损害、脑膜炎、中枢神经系统肿瘤等疾病的临床诊断。其需求量在逐年增加,实现溶菌酶高效快速的分离纯化意义重大。蛋白质印迹材料能特异性识别模板蛋白,制备简单,性质稳定,能重复使用;溶菌酶分子印迹材料,具有较大的研究和应用价值。本文从化工分离的角度研究蛋白质分子印迹材料的制备、结构与性能。以温度响应聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)为主要原料,以溶菌酶为模型分子,进行了溶菌酶印迹材料的制备及结构与性能研究。研究了吸附容量、温控吸/脱附、吸附动力学,并构建了数学模型。主要内容及结论如下:(1)Lysozyme亲和吸附微凝胶的制备。分别以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和N-乙烯己内酰胺(NVCL)为主要原料,引入蛋白质氨基酸残基互补单体,制备了亲和吸附微凝胶,研究了配体对微凝胶低临界共溶温度(LCST)调控规律和吸附性能的影响、温度响应单体对亲和沉淀性能的影响。结果表明,当甲基丙烯酸(MAA)含量小于10.00%时,随MAA含量的增加微凝胶LCST逐渐升高,大于10.00%时聚合物LCST消失;叔丁基丙烯酰胺(TBAM)降低微凝胶的LCST。在凝胶LCST以内,MAA含量的增加能提高Lysozyme吸附量,TBAM含量的增加对吸附量影响不大,MBA含量为2.00%时吸附量最佳。常温下在低浓度磷酸盐体系中PNVCL基温度响应微凝胶有良好自絮凝分离性能,沉淀析出率接近90.00%,而PNIPAM基温度响应微凝胶不会自絮凝分离。(2)为提高亲和吸附凝胶的分离性能,采用改进的St(?)ber法,合成了系列尺寸的Si O2微球;利用ATRP技术在其表面接枝PNIPAM基聚合物,制备了复合纳米微球;研究了其对Lysozyme的吸附容量、温度响应吸脱附及吸附动力学。结果表明复合纳米微球在温度大于LCST时平均吸附容量为70.37 mg·g-1,在低于LCST脱附后平均吸附容量为14.63 mg·g-1,有79.20%吸附量能做到温控吸附-脱附;经过7次循环吸附量没有明显下降,复合纳米微球稳定性良好;等温吸附和动力学吸附模型拟合表明复合纳米微球对Lysozyme吸附是Langmuir EXT1等温吸附和准一级动力学吸附。(3)为进一步提高亲和吸附复合材料的分离性能,合成了超顺磁Fe3O4并利用Si O2对其进行包覆。进而在Fe3O4@Si O2表面引发ATRP,制备了磁-温度双重响应Lysozyme印迹纳米微球,利用SEM,DLS观察了纳米微球微观形貌,FT-IR、~1HNMR、XRD表征了纳米微球的化学组成和结构,TGA分析了纳米微球的热稳定性及其表面接枝率,UV-Vis测定了纳米微球的LCST,SDS-PAGE分析了纳米微球对Lysozyme吸附的选择性。实验结果表明,纳米微球对Lysozyme的吸附可以通过温度调控,可以在温度高于LCST时吸附,低于LCST时解吸。等温吸附和动力学吸附模型拟合表明磁性印迹纳米微球对溶菌酶吸附是Langmuir EXT1等温吸附和准一级动力学吸附,平衡吸附量为117.12 mg·g-1,50 min达到吸附平衡,3 min实现磁分离,SDS-PAGE表明纳米微球对Lysozyme具有选择性。表面印迹聚合物与非印迹相比,Lysozyme吸附量提高了33.74%。该材料适用于Lysozyme的亲和吸附纯化。
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