T-2毒素和黄曲霉毒素均是由真菌产生的有毒次级代谢产物,在自然界中分布广泛,成为花生、玉米、大豆、大米等农作物的主要污染物,严重影响农产品的产量及其质量。它们不仅能够对人、畜产生免疫毒性、细胞毒性,而且还有较强的致癌作用,其中黄曲霉毒素被认为是迄今发现的最强致癌物质之一。基于真菌毒素对人畜的危害,很多国家对农产品中真菌毒素的含量都制定了限量标准,并将此作为贸易壁垒的手段之一。随着人们生活质量的不断提高,人们对日益突出的食品安全问题看得越来越重,要求也越来越高,食品安全问题更关系到社会稳定与和谐。如何突破国际贸易壁垒,减少经济损失,让人们吃上安全放心的食品成为我们亟待解决的问题,而研究建立真菌毒素的免疫分析技术是解决这一问题的重要手段。抗体是免疫分析技术的核心,抗体的特异性和灵敏度直接决定着免疫分析技术的好坏。以往的免疫分析检测技术大都是基于单克隆抗体和多克隆抗体,杂交瘤细胞能够在体外无限繁殖,只要细胞株不发生基因突变,就可以通过培养无限的生产高特异性、高均一性的单克隆抗体抗体,但是目前已报道的T-2单克隆抗体的灵敏度不够高、特异性不强,还不能满足检测需求,因此研制更高灵敏度的T-2单克隆抗体势在必行。近年来,纳米抗体逐渐走进人们的视野,它以耐有机溶剂、耐高温、耐酸碱性等诸多优点而备受人们期待,基于纳米抗体的检测技术也应运而生,开创一个全新的研究领域。随着对纳米抗体的需求量的增加,如何实现纳米抗体的批量生产必将成为纳米抗体技术发展中至关重要的一环。针对上述问题,本研究的内容和创新点如下:1.研制出高灵敏度的抗T-2毒素的单克隆抗体。首先将T-2毒素与琥珀酸通过琥珀酸酐法反应生成T-2HS,再通过活泼酯法,将T-2毒素半抗原分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)共价偶联,合成出T-2毒素人工抗原T-2HS-BSA和T-2HS-OVA,以T-2HS-BSA作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与相应比例的小鼠骨髓瘤细胞进行融合,采用半固体培养基进行培养,并通过两步筛选法进行筛选分泌抗T-2毒素抗体的杂交瘤细胞株。用间接竞争法检测单克隆抗体的特异性,共获得4株性能良好的单克隆细胞株,分别是1D6、2A8、2C5和4G3。其中2C5所分泌抗体的灵敏度(IC50)为0.13ng/mL,分泌抗体的性能稳定,特异性强,与HT-2的交叉反应率为4%,与FB1、DON、ZEN无交叉反应。与已有报道相比,2C5是目前最好的抗体。2.利用2C5抗体研究建立了间接竞争ELISA检测方法,最低检测限为0.015ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为0.05~57.6 ng/mL,该方法对大豆、玉米、花生等粮油产品的检测范围为0.5-576μg/kg,在线性范围内加标回收率为93.5%~107.5%,本研究建立的检测方法可用于大豆、玉米、花生等多种粮油产品中T-2毒素的检测。3.研究建立了黄曲霉毒素B1纳米抗体批量制备技术。利用本实验室已获得的菌株,通过对纳米抗体表达的最适诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度等条件的优化,探明最佳诱导温度为33℃,最佳诱导时间为10h,最佳诱导剂浓度为1mmol/L。建立了基于发酵罐的纳米抗体批量生产技术。批量生产的黄曲霉毒素B1的纳米抗体灵敏度(IC50)为0.75ng/mL,特异性良好,这与何婷微量制备的纳米抗体相比,抗体主要技术参数基本保持一致,而抗体的产量得到了大大提高。4.研制出纳米抗体免疫亲和柱。利用制备的纳米抗体,通过参照传统亲和柱的制备方法,研制出了新型的免疫亲和柱,亲和柱的柱容量为200ng,通过与传统免疫亲和柱的重复利用实验,结果表明纳米抗体免疫亲和柱具有良好的耐有机溶剂性,并且这种特性并不影响靶标物的洗脱。