前言脑胶质瘤是中枢神经系统常见的恶性肿瘤,其发病率约占颅内肿瘤的45%,传统多采用手术治疗。由于脑胶质瘤呈浸润性生长,大多与正常脑细胞组织无明显分界,一些部位深的肿瘤常侵犯脑重要功能区,手术难以切除根治,化疗是其主要的治疗方法之一。在脑胶质瘤中,即使肿瘤组织可以局部、不均一地破坏血脑屏障（BBB）,但是血肿瘤屏障（BTB）的存在仍然限制药物进入肿瘤组织。常规化疗的失败不是因为药物本身,而是没有足够的药物进入肿瘤组织。尤其是近年来,随着分子生物学技术的发展,许多肽类,蛋白质,多核苷酸等物质作为潜在的抗肿瘤药物的发现,由于其分子量大无法穿透BTB,限制了这些药物的临床应用。药物通过BTB一般有两种途径:细胞旁途径和跨细胞途径。根据药物理化性质,亲水性药物以细胞旁途径,亲脂性药物以跨细胞途径转运通过BTB,并且跨细胞途径能够转运与白蛋白大小相似或比其大的血浆蛋白。在正常BBB和BTB,脑微血管内皮细胞（BMECs）具有很低的胞吞转运功能,限制了许多大分子和颗粒性药物进入脑组织和肿瘤组织。如何增加BMECs跨细胞转运是增加化疗药物进入肿瘤组织、提高化疗疗效的关键。为了有效的转运药物进入肿瘤组织而不影响正常脑组织,需要寻找能够选择性开放BTB的策略,这既可以使治疗药物靶向进入肿瘤组织,提高药物疗效,又减少药物对正常脑组织的毒副作用。应用低频超声辐照在一定声强控制下可非侵袭性、可逆性、选择性开放BBB,而不损害辐照部位的脑组织。低频超声辐照能通过增加BMECs吞饮小泡的数量增强BBB的胞吞转运功能,但是具体的分子机制不清。小剂量缓激肽（BK）颈内动脉灌注可以选择性开放BTB,而不影响正常脑组织。BK主要是通过位于胶质瘤细胞的B₂受体起作用:BK与B₂受体结合后,增加细胞内Ca²⁺浓度,增高的细胞内Ca²⁺能激活一氧化氮合成酶（NOS）产生一氧化氮（NO）。NO进而激活可溶性鸟苷酸还化酶（sGC）,产生高浓度cGMP,引起吞饮小泡增加,使BTB通透性增加。质膜微囊（Caveolae）是细胞质膜表面特异性的内陷囊状结构,是一种参与内皮细胞跨细胞转运的细胞器,它的主要功能是转运大分子物质或内化小分子物质进出细胞。Caveolins是caveolae的主要功能结构蛋白。在脑组织中,caveolin-1,2主要表达在BMECs中,caveolin-3主要表达于星形胶质细胞。Caveolin-1修饰于caveolae的内表面,是caveolae的标志性蛋白,在维持caveolae形态、结构、功能中起重要作用。Caveolin-2与caveolin-1有相同的组织和细胞分布,caveolin-2对caveolin-1的结构维持,膜定位及调节caveolae的动力学方面有重要作用。Caveolin-1与caveolin-2形成稳定的异源寡聚体复合物,共同定位于caveolae的质膜区域内,二者共同参与BMECs的胞吞转运过程。本研究首先确定低频超声辐照开放BBB,而没有脑组织损伤的声学参数,然后通过建立大鼠C6胶质瘤模型,应用组织学、分子生物学等方法,证明低频超声辐照通过增加BMECs胞吞转运选择性开放BTB的分子机制,并且联合应用小剂量BK以求最大限度增加BMECs胞吞饮转运,为临床靶向提高BMECs跨细胞途径转运药物的治疗策略提供理论基础。材料与方法1、低频超声辐照:德力凯公司EMS-900型脑超仪器（中国医科大学附属第一医院脑功能检查室）,探头频率1.0MHz,探头直径2.0cm,功率在一定范围内可调。造影剂Optison在每一个辐照前10s经右股静脉注入,注射容量为0.05ml/kg。2、超声窗的制作（降低低频超声波的衰减,为了研究精确）:Wistar健康雌性大鼠,由中国医科大学实验动物中心提供,体重180～200g。术前10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉,头顶部皮肤用剪刀剪去,固定于立体定位仪上,正中矢状切开约2cm切口,钝性剥离骨膜,用牙科钻以大鼠冠状缝上中线右旁开3mm为中心各移去一块颅骨（3×3mm）,将表皮覆盖在骨窗并缝合上,5天后备用。3、大鼠C6胶质瘤细胞的培养:含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基,37℃,湿度100%,5%CO₂条件下培养。4、大鼠C6脑胶质瘤模型的制备:常规培养C6大鼠胶质瘤细胞,用不含胎牛的高糖DMEM培养基制备细胞悬液,浓度为1×10⁶/10μl。腹腔注射10%的水合氯醛（3.5ml/kg体重）麻醉大鼠,在立体定位仪上用微量进样器注入大鼠右侧脑尾状核10μl C6胶质瘤细胞悬液,靶点为冠状缝前1 mm,矢状缝右侧旁开3 mm,深4.5 mm。肿瘤细胞移植10-14天后备用。5、应用伊文思兰（Evans blue,EB）和透射电镜确定低频超声辐照开放BBB,没有辐照部位脑组织损伤的声学参数。6、应用EB检测低频超声辐照后不同时间点及联合小剂量BK后BTB通透性变化。7、透射电镜观察低频超声辐照后不同时间点及联合小剂量BK后BTB中BMECs吞饮小泡数量的改变。8、应用S-P免疫组织化学法和免疫荧光化学法检测低频超声辐照后不同时间点及联合小剂量BK后BTB中BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的分布和表达变化。9、应用RT-PCR法和Western blot法检测低频超声辐照后不同时间点及联合小剂量BK后肿瘤组织中脑微血管段质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达变化。10、建立体外BTB模型,应用免疫荧光化学法检测低频超声辐照后BTB中BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的蛋白表达和分布改变。结果1、应用低频超声辐照（频率1.0MHz,功率12mW,辐照时间20s）能够选择性开放BBB,未见辐照部位脑组织的损伤。2、低频超声辐照后BTB的EB渗出量增加,BMECs吞饮小泡数量增加,辐照后1.5h EB渗出量最大,BMECs吞饮小泡最多,12h后EB渗出量和吞饮小泡数量恢复未辐照水平。3、低频超声辐照后BTB中BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达升高,辐照后1.5h达峰值,12h后恢复未辐照水平。4、体外BTB模型中,低频超声辐照后BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2表达明显增加,辐照后1.5h达峰值,12h恢复原来水平,caveolin-1和caveolin-2蛋白的分布呈现由细胞膜到细胞质的分布改变过程。5、低频超声辐照联合小剂量BK与二者单独应用相比能够最大限度增加BTB的EB渗出,显著增加BTB中BMECs吞饮小泡的数量和质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达。结论1、低频超声辐照（频率1.0MHz,功率12mW,辐照时间20s）能够选择性开放血脑屏障。2、低频超声辐照能够增加BTB的EB渗出和BMECs吞饮小泡的数量通过跨细胞途径增加BTB的通透性。3、低频超声辐照能够增加BTB中BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达。4、低频超声辐照联合小剂量BK与二者单独应用相比显著增加BTB的EB渗出和BMECs吞饮小泡的数量通过跨细胞途径增加BTB的通透性。5、低频超声辐照联合小剂量BK与二者单独应用相比显著增加BTB中BMECs质膜微囊结构蛋白caveolin-1和caveolin-2的mRNA和蛋白表达。6、质膜微囊结构蛋白caveolin-1,caveolin-2的表达水平上调可能是BMECs增加胞吞转运的分子机制。