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耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)是至今发现的抗辐射能力最强的生物之一,对电离辐射、UV辐射、过氧化氢等压力具有很强的抗性。耐辐射球菌可以耐受5 kGy的电离辐射而不受影响。高效的DNA修复能力、多种抗氧化机制和快速DNA损伤响应能力,对耐辐射球菌的极端抗性做出了巨大的贡献。DNA与RNA相伴而生,是一对孪生分子。生命的起源可能最早是“核酸世界”,DNA与RNA是后来分化产生的。在生命系统中,DNA、RNA和蛋白质起着决定性的作用,成为生命系统中的三驾马车,核酸解旋酶的重要作用自然不言而喻,而在耐辐射球菌中系统性研究核酸解旋酶的文章却罕见报道。
耐辐射球菌基因组编码了18种核酸解旋酶,本文选取了NCBI注释过的全部3种RNA解旋酶和随机选定的3种DNA解旋酶进行了研究,它们是DR1624、DR0335、DRB0135、DRB0136、DR0065、DR1532。我们首先利用基因重组技术将抗性基因替代目标基因,进而成功地构建了目标基因的敲除突变株。为研究这些激酶在耐辐射球菌电离辐射后恢复中的作用,我们比较了这些突变株与野生株在DNA损伤因子胁迫下的生存率。结果发现,drb0136、dr1532两个基因的突变株抗逆性与野生型菌株相比相差不大,表明这两个基因对抗逆性没有明显的贡献,它们在耐辐射球菌体内不甚重要。而其他四种核酸解旋酶突变菌株对γ辐射、UV辐射和过氧化氢等DNA损伤因子较为敏感。其中dr1624的缺失导致耐辐射球菌对过氧化氢非常敏感。为了更好的理解突变菌株出现的抗逆性表型,我们进一步研究了这6种核酸解旋酶突变菌株的抗氧化活性。结果表明,dr1624、drb0135两个基因突变菌株的抗氧化活性能力最差,与野生型菌株R1相比甚至于出现了4到5倍的巨大差异,而另一个RNA解旋酶突变株的抗氧化活性也比选定的3种DNA解旋酶突变菌株低。表明在耐辐射球菌体内RNA解旋酶体现出了极强的重要性。
dr1624的突变导致耐辐射球菌的生长速度大大降低,而且突变株的生长表现出了明显的温度敏感特性,预示着其可能是一个冷激蛋白。而对于体外活性实验的结果整体来说,RNA解旋酶突变株的敏感性要强于DNA解旋酶的敏感性。这或许是由于耐辐射球菌中具有15种DNA解旋酶以及它本身强大的DNA修复机制所致。
鉴于dr1624缺失突变株的温度敏感性、超低生长速度以及对各种抗逆性的敏感性,特别是对于过氧化氢的敏感性,我们尝试在体外表达了DR1624蛋白,在多次尝试改变条件后,DR1624全长蛋白表达依然失败,我们只表达了其C末端截短体蛋白。同时,我们发现在NCBI上dr1624的基因序列有误,其N末端比实际缺失了部分氨基酸,而且由于移码突变造成了其实际序列提前终止。
本研究表明核酸解旋酶,特别是RNA解旋酶参与了耐辐射球菌的抗性,但是其具体机制尚需进一步的研究。