多囊肾病(Polycystic Kidney Disease, PKD)是一种常见的、单基因、多系统性障碍疾病,根据遗传方式不同,可分常染色体显性遗传多囊肾病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease, ADPKD)和常染色体隐性遗传多囊肾病(Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease, ARPKD)。本病发病率高,其中ADPKD的发病率高达1/400-1/1000[1,2],ARPKD的发病率也有1/20000,全球目前有大约1200多万多囊肾病人。ADPKD的特点是肾脏囊肿进行性发展,约50%的ADPKD病人最终发展成为终末期肾病(ESKD),只能进行血液透析或肾移植维持生命[3]。除肾脏囊肿外,ADPKD通常还伴有各种肾外表现,如肝脏、胰腺、精囊和蛛网膜膜囊肿,颅内动脉瘤的患病率比正常人群高出五倍左右,伴有显著的高发病率和高死亡率[4]。ARPKD则被称为婴儿型多囊肾,30%-50%的患病胎儿在围产期就因为疾病的发作导致羊水过少、肺发育不良而死亡。多囊肾病尤其是常染色体显性遗传多囊肾病往往伴有家族史,对家庭及个人均带来沉重的精神和经济负担。对多囊肾病的诊断目前主要依据双肾的超声、CT等影像学手段进行检查,虽然ADPKD大多伴有典型的家族疾病史而较容易通过影像学明确诊断,基因层面的确诊对明确多囊肾病类型、预后及产前诊断预防该病发生起着更为关键的作用。研究表明,ADPKD通常由常染色体16p3.3区的PKD1及4q21区的PKD2两个基因突变致病,其基因产物分别是多囊蛋白1(Polycystin-1, PCI)和多囊蛋白2(Polycystin-2, PC2)。PC1为介导细胞-细胞间相互作用的膜蛋白而PC2则是一种非特异性阳离子通道；ARPKD则与6p12区域的PKHD1基因突变相关,其基因产物则是Fibrocystin/Polyductin (FPC)。对多囊肾病的致病基因研究发现, ADPKD和ARPKD均以点突变致病为主,大片段缺失、重复或重排只占致病原因的极少数(3%-4%)。因此,对多囊肾病的基因诊断技术以序列测序为主。然而,相对其他遗传性单基因疾病诊断,多囊肾基因的诊断要复杂的多,尤其是对ADPKD基因的诊断目前存在几个方面的困难。首先,ADPKD具有明显的基因异质性,PKD1和PKD2两个基因变异均可引起ADPKD,其中PKD1基因突变占全部病因的85%,临床表型也较PKD2基因突变病人严重得多,病人透析或肾移植时间平均要比PKD2基因突变病人提前20年发生。其次,现有的研究证明,ADPKD基因突变不存在所谓的热点,意味着PKD1或PKD2突变位点有着高度的不确定性,基因的整个蛋白编码区域及转录剪切位点都可能发生突变而导致疾病的发生。第三,PKD1基因1-33号外显子存在6个序列高度相似的假基因,并且此基因空间结构复杂,部分区域GC含量高达70%甚至80%,这些都给PKD1基因测序和突变分析带来了极大困难。目前虽已有多种方法可对多囊肾基因进行变异诊断,但均存在技术上的缺陷和不足,难以广泛应用。随着新一代测序技术(NGS)的日臻成熟,NGS在遗传性疾病诊断中的应用越来越多。由于NGS技术可以同时对大量DNA片段进行并行处理,其测序效率比传统的Sanger测序大幅提高,加大测序深度后还可检测极低比例的嵌合变异。因此,NGS新技术的应用将能有效克服多囊肾基因诊断的技术瓶颈。由于ADPKD是一种非常典型的家族遗传性疾病,该病具有迟发性的特点,很多患者在疾病确诊时已经结婚生子,遗传给下一代的可能性高达50%,这给患者的家庭带来极大的精神压力和经济负担。因此ADPKD患者有着非常强烈的愿望截断此基因突变位点的遗传,生一个健康的孩子。开展产前诊断或者胚胎植入前遗传学诊断对ADPKD及ARPKD和其他遗传性疾病的早期预防、早期干预有着非常重要的意义。无论是先证者的突变位点检测还是开展产前诊断或胚胎植入前诊断,对PKD病人的致病位点进行精确定位是最关键的步骤,因此对PKD1、PKD2及PKHD1基因全外显子序列及剪切位点的检测就显得特别重要。本研究拟通过对目前已有的多囊肾基因诊断体系进行改良,建立了一种高效、特异及简便的多囊肾基因变异诊断体系,并将其应用于产前诊断。同时本研究将评价高通量测序技术在多囊肾基因诊断中的应用情况,在常规测序技术的基础上建立一套高效、特异的多囊肾病基因高通量诊断体系,为多囊肾病或其他单基因遗传病的基因诊断提供良好的研究基础。第一章多囊肾基因变异诊断体系的建立及其在产前诊断中的应用研究目的本研究的目的在于建立更方便、高效、特异和省时的多囊肾基因变异诊断体系,通过对先证者的基因诊断明确变异位点,并将此技术应用于产前诊断中,为早期诊断、预防多囊肾病提供技术支撑。通过改良目前已有的繁琐的ADPKD诊断方法,本研究将力争最大程度简化反应条件,设计特异性引物高效扩增PKD1基因；建立特异性长片段PCR方法,避免假基因序列的干扰,从而为后续巢式PCR提供特异性模板；在此基础上设计PKD1单个外显子特异性引物,以巢式PCR产物为模板进行特异性扩增,从而进一步减少测序反应时非特异产物带来的干扰,为准确定位PKD1基因变异建立良好的基础。本研究还将建立统一、简便的Touch-down扩增体系,使PKD1、PKD2及PKHD1所有外显子扩增反应均可在单一条件下进行。简便的反应条件将有利于此反应体系在基层医院推广和应用。本研究还将在多囊肾基因诊断体系建立的基础上,结合基因芯片等技术对包括多囊肾基因致病变异及其他泌尿系统超声异常的胎儿进行产前诊断,进行出生缺陷的早期干预。研究方法病例来源1、本研究32例显性多囊肾病例、4例隐性遗传多囊肾病胎儿病例及42例行基因芯片产前诊断样本均来源于广州医科大学附属第三医院、广州军区广州总医院。其中,在课题进展期间,利用已建立的诊断体系与香港卫生署医学遗传科合作开展ADPKD基因诊断15例。所有经临床诊断为PKD的病例先证者均具有明显的多囊肾临床表现；所有参与课题的志愿者均签署有知情同意书。2、利用本体系明确先证者变异位点,对患有多囊肾病的孕妇或丈夫为多囊肾病的孕妇进行产前诊断；对超声提示胎儿为婴儿型多囊肾的孕妇利用羊水组织或绒毛组织进行基因的直接检测,并对胎儿父母基因型进行验证。3、运用全基因组芯片对超声提示泌尿系统异常的胎儿进行全基因组范围内基因拷贝数变异的检测,结合多囊肾测序方法,完善泌尿系统异常胎儿的产前诊断分子检测体系。实验方法：1、运用PRIMER3在线软件,直接设计PKD2、PKHD1基因所有外显子引物；运用UCSC等在线软件,通过比对序列特异性,寻找PKD1假基因与真基因序列间的微小碱基差异,设计特异性长片段引物；2、建立特异性长片段PCR方法：引物设计时各引物的退火温度均设计为接近60℃,选用高度特异的长片段扩增酶进行PCR反应；PCR反应产物经0.5%琼脂糖电泳鉴定；3、PKD1特异性外显子PCR引物设计：引物设计原理同长片段引物设计,UCSC中通过比对寻找单个外显子与假基因序列的差异碱基,从而设计特异性引物；4、设计Touch-down条件进行PCR反应,PKD1、PKD2、PKHD1三个基因的所有外显子均可在一个反应条件下进行；5、扩增产物的纯化及测序PCR反应,利用3500XL遗传分析仪进行序列分析；6、利用Mutation Surveyor软件进行测序结果的自动判读；7、数据的生物信息学分析：所有测序结果再次查询相关生物信息学网站后进行临床意义的二次判断；8、产前标本个体识别,确保产前诊断样本为胎儿源性。对先证者中已发现的变异位点进行靶向性检测,明确胎儿基因型。同时对超声提示泌尿系统异常的42例胎儿进行了羊水标本的全基因组芯片检测,以排除基因拷贝数变异或染色体水平的异常。研究结果1、特异性设计PKD2、PKHD1两基因所有外显子引物,所有引物退火温度均接近60℃。经电子PCR预测,所有引物均具有特异性产物；2、经序列比对,在PKD1基因1-34号外显子区域设计出七对长片段引物,分别扩增出PKD1基因第1号外显子,2到8号外显子,9到12号外显子,13到15外显子,15到21外显子,22到26外显子及27到34号外显子,其余外显子(35到46外显子)因不涉及假基因序列,只进行单个外显子引物设计及扩增；3、所有长片段产物经电泳鉴定,条带唯一,片段大小与设计相符；4、在长片段产物的基础上,经序列比对,设计出56对PKD1单个外显子扩增引物,经电泳验证,均为单一产物,特异性高：5、对单个外显子扩增条件如退火温度、延伸时间等优化后,建立了特异、高效及简便的Touch-down PCR扩增体系及条件,所有三个基因的全部单个外显子均能高效、特异地在一个条件下扩增得到产物；6、对前期10个ADPKD患者自愿者进行体系的效能检测后发现,优化的体系能高效检出变异位点。10个病例共检出9个变异,均为PKD1基因点突变,其中7个为致病性变异；一个变异同时在两个病人中检见；另外2个变异经生物信息学预测为可能致病性变异。4个变异经文献及数据库检索,为未见报道新变异。体系建立后对另外22例ADPKD患者进行了检测,共在15例患者中发现明确的致病位点；可疑致病位点7例,均为错义变异；7、对4例超声提示胎儿为婴儿型多囊肾病的产前标本检测发现,PKHD1基因多为双重杂合突变。对5例ADPKD患者进行了产前诊断,抽取早孕期绒毛组织进行了样本与母体DNA的个体识别以确保检测样本为胎源性。2例胎儿样本发现与先证者一样的变异。对超声提示泌尿系统异常的42例胎儿的羊水标本的全基因组芯片检测发现3例存在致病性基因拷贝数变异,阳性率7.14%。研究结论1、本研究建立了高效、特异的长片段PKD1基因扩增体系,致病性变异的检出率大于70%,致病性及可疑致病性变异的检出率大于90%；2、本研究建立的多囊肾诊断体系可高效、快速同时检测PKD1、PKD2、 PKHD1基因点突变；3、结合超声情况和多款生物信息功能预测软件,本研究可为明确多囊肾病基因型提供准确的检测结果；4、应用此体系检出了4个未见报道的PKD1新致病位点；5、全基因组芯片应用于泌尿系统超声异常胎儿检测有助于发现染色体异常或细微水平的拷贝数变异,可进一步提高产前诊断阳性检出率。第二章高通量测序技术在多囊肾病基因变异诊断中的研究应用研究目的虽然在前一章中我们已建立了高效、特异的多囊肾基因变异检测体系,相对于传统检测方法已进行了较大程度的改良,但由于多囊肾病因复杂、致病基因外显子多等因素,整个检测过程工作量仍偏大。并且传统Sanger测序方法只能针对点突变和微小缺失、插入等变异进行检测,而对大片段缺失重复还需要进行多重链接探针扩增实验(MLPA)进行检测。因此本研究通过运用最新的高通量测序NGS技术,比较全外显子捕获和高效靶目标捕获两种方法对多囊肾PKD1、PKD2、PKHD1基因全部蛋白编码区域、剪切位点及其他标靶基因序列的测序数据,建立了适合实验室开展的一次性大规模平行测序检测多个样本包括多囊肾基因在内的多种遗传性疾病基因变异检测方法,为NGS技术在多囊肾等遗传性疾病中的推广应用积累经验。研究方法病例来源用于高通量测序的5例ADPKD样本和2例ARPKD样本均来源于广州医科大学附属第三医院和广州军区广州总医院,所有样本均在前一章已通过常规测序方法明确基因型和变异位点。抽取先证者外周血提取基因组DNA进行高通量测序反应。对同一例样本同时行全外显子捕获和靶目标捕获两种方法建立文库,比较两种方法在PKD基因检测上的效率。同时检测了一例低比例嵌合变异样本。实验方法1、直接提取患者外周血基因组DNA；2、运用常规多囊肾诊断体系,明确所有病例的变异位点；3、基因组DNA片段化：利用Covaris S2仪器进行基因组DNA剪切,将基因组DNA片段化成200-300bp的小片段；4、样本纯化：使用Agencourt AMPure XP磁珠进行样本的纯化；5、对已打断的片段进行末端修复、去尾、纯化、3’末端加A尾；6、与测序接头相连接；7、PCR扩增带有接头的DNA片段,并对产物进行纯化8、Qubit荧光定量仪检测文库质量9、对文库进行全外显子捕获10、对样本进行基因芯片捕获,捕获前对文库进行LM-PCR扩增；将扩增后的样品与芯片进行杂交；11、芯片清洗,去除未结合序列,然后将捕获序列洗脱下来；12、对捕获后样品再次进行扩增；13、通过文库定量估计目标区域的相对富集倍数,达到质控要求后即可进行测序前准备；14、高通量测序分析,Illumina HiSeq2000仪器连续双向测序90个循环；15、测序数据的分析。研究结果1、常规PCR测序验证PKD变异位点,确认所有准备上高通量测序的样本的变异位点；2、文库质量评价：文库质量经Tape-Station仪器检测,文库片段大小、分子量均符合要求；3、测序数据的预处理：运用软件除去数据中的低质量或仪器读取错误的序列；4、基因芯片靶序列捕获法NGS有效数据分析：PKD1、PKD2和PKHD1三个转录本外显子作为目标靶序列比对,共得到173559条有效靶序列读数,占全部有效序列的0.229%。最低测序深度从0(即无有效序列覆盖),最高测序深度为2363条,平均测序深度为190,5倍以上测序深度占全部有效序列的85%以上；5、外显子杂交捕获法NGS有效数据分析：经去除重复序列上的读数,实验得到PKD1、PKD2和PKHD1三个转录本有效靶序列读数仅14122条,占全部有效序列的0.027%。最低测序深度从0(即无有效序列覆盖),最高测序深度为309条,平均测序深度为28.34,5倍以上测序深度占全部有效序列的55.35%；6、测序数据覆盖度分析：全外显子捕获法目标区域覆盖度很低,PKD1外显子覆盖度小于40%；基因芯片靶序列捕获法有较高的覆盖度,三个基因整体覆盖度95%,但PKD1外显子仍有近200-300bp区域不能覆盖；7、因全外显子捕获法不能有效覆盖目标区域且易将重复序列读数误认为是测序错误而删除,数据质量较差；基因芯片靶序列捕获法能快速、准确检测样本变异；8、NGS技术准确快速发现所有验证样本变异,对一例低比例嵌合变异检测效率更敏感；9、虽不能有效检测PKD基因,但全外显子捕获法的优势是可以通过测序数据进行CNV和染色体非整倍体的检测。研究结论1、本研究发现基于NGS技术的PKD1基因诊断平台,基因芯片靶目标捕获法有较好的测序数据结果,而全外显子捕获法并不适合PKD1基因的NGS检测；2、建立了一套适宜临床检测的NGS实验室检测操作流程；3、NGS技术对复杂结构基因、高GC含量区域的检测仍有不足之处,需结合常规Sanger测序进行相互补充：4、与经典Sanger测序相比,NGS技术具有周期短、花费少、结果稳定的优势,对于多样本、大基因的检测,NGS技术是一个优先的选择；5、除了检测点突变及微小插入、缺失外,NGS还可以同时检测基因拷贝数变异和染色体非整倍体,同时可以检测低比例的嵌合变异,具有较高的敏感性、准确性,更适合PKD基因变异的检测。