纤维素是自然界中含量十分丰富的有机物,其完全降解过程需要几种酶的共同参与、协调配合。纤维素酶具有催化效率高、安全性好等优点,在纺织、洗涤、动物饲料添加剂等方面应用广泛。本实验室选育的纤维素酶产生菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)X10-279,遗传性状稳定,滤纸酶活为16.70 IU/m L。在纤维素酶的共同参与下,纤维素降解生成葡萄糖,纤维二糖水解酶(CBH?)是纤维素酶系中唯一可以作用于结晶纤维素的组分,在纤维素降解过程中起重要作用。本研究克隆并在大肠杆菌中表达草酸青霉X10-279纤维二糖水解酶基因cbh?,希望能够获得高纤维素活性的重组菌,从而提高纤维素的降解效率。根据Gen Bank中已发表的青霉属来源的纤维二糖水解酶基因cbh?,分别设计含有Eco R?和Not?限制性酶切位点的正向引物和反向引物。以草酸青霉X10-279基因组DNA为模板,进行PCR,将回收得到的PCR产物与克隆载体p MD18-T连接,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Top 10感受态细胞中,将重组菌进行测序,重组质粒命名为p MD18-T-cbh?。生物信息学分析表明:克隆得到的X10-279纤维二糖水解酶基因cbh?(Gen Bank,获得基因登录号KR269867,蛋白登录号AKI32221)全长1632 bp,无内含子,编码543个氨基酸和一个终止密码子。与斜卧青霉(Penicillium decumbens)CBH?(Gen Bank登陆号ACV95805)的同源性最高,氨基酸序列同源性达98.70%。蛋白理论分子量为56.66 k D,理论等电点为4.79,属于糖基化水解酶第7家族。重组质粒p MD 18-T-cbh?双酶切获得的cbh?与表达载体p ET-28a(+)连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,成功构建了重组菌p ET-28a(+)-cbh?/BL21。目的蛋白在宿主中实现了大量表达,但主要以包涵体的形式存在。对诱导条件进行优化,确定最佳诱导条件为:当OD600达到0.3~0.4时,加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,在37℃诱导5 h,目的蛋白的表达量达到15.14 mg/L,比优化前提高了50.49%。利用Ni柱对包涵体进行纯化,纯化后蛋白的表达量为3.29μg/m L,收率为21.35%。对目的蛋白进行复性,复性后蛋白的p NPC酶活为10.3 U/L,比活力为94.3 U/mg,最适p H为5.0,最适温度为55℃,且具有较好的温度适应性。