禽传染性支气管炎(IB)呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒(IBV)很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了严重的经济损失。在前期工作基础上，本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析，并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究，在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究，为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。1．选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株，采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明：SAIBk株能引起鸡胚矮化，形成侏儒胚；其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子；SAIBk株基因组全长27520bp，核苷酸组成中A+T的含量占61.74％；具有典型的冠状病毒基因组结构，其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b，20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白；SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6％-87.6％之间；不同区域的同源性比较结果表明，3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域，同源率介于90％-98％之间，而S1基因是基因组中变异最大的区域，同源率介于74.8％-83.2％之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定，丰富了冠状病毒的生物信息数据库，为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。2．选择11株IBV分离株，采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明：11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间；将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析，表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失，不同毒株之间碱基数目最大相差208bp；根据不同毒株在3′非编码区片段的大小，可以将26个毒株分成4组；26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组，基因Ⅲ型毒株属于第三组，基因Ⅳ型毒株属于第四组，而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列，为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。3．构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒，转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明：酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed；在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号；转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞，细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光，荧光的强度随着转染时间的增加而增强；pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞，激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域，且分布不均匀，表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集；pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究，为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。4．选择高效的真核表达载体pcDNA3.1(+)，将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点，构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定，用脂质体转染Vero细胞，进行蛋白的表达和鉴定。结果表明：酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确；通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒，并在细胞中进行了表达检测，为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。5．将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明：雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后，均能产生特异性抗体，对强毒的攻击具有一定的保护力，其中pIBVM的保护率为37.5％；将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力，均要优于单基因的效果；将三基因混合的质粒以脂质体为佐剂进行免疫原性研究，在试验期间脂质体包裹DNA疫苗组与裸质粒疫苗组的抗体水平差异不显著，但前者的抗体水平一直要高于后者；脂质体包裹DNA疫苗组的外周血CD4~+T、CD8~+T淋巴细胞数量要显著高于裸质粒疫苗组，两者差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)；在攻毒保护率上，脂质体包裹DNA疫苗组的保护率为72.7％，要优于三基因混合裸质粒DNA疫苗组的54.5％。本研究首次在国内外对M基因及S1、M、N基因混合DNA疫苗的免疫原性进行了比较研究，研制出脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗，对有效的预防和控制IB的流行具有重要的意义。