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黑色素瘤是一种恶性肿瘤,具有很强的转移能力和极高的致死率。紫外线是黑色素瘤形成中最主要的外源性致癌因素。近年的研究表明,肿瘤的发展不是一个独立事件,肿瘤与肿瘤微环境中间质细胞的相互作用在肿瘤的发展中起着重要作用。外泌体是一种细胞主动分泌的纳米级囊泡,直径约为50~150 nm,具有脂质双层膜结构,可以从不同的细胞类型中释放,内含完整的m RNA、mi RNA、蛋白质、脂质等分子。由于肿瘤外泌体可以介导这些信息分子从肿瘤细胞转移到正常间质细胞中,并发挥多种促癌功能,因此肿瘤外泌体被认为是致癌信息的细胞间传递介质,可以介导肿瘤细胞对肿瘤微环境的调控作用。成纤维细胞(MEF)是肿瘤微环境中主要的组成成分,大量研究表明,肿瘤微环境中的成纤维细胞通过分泌MMP2、MMP9进行基质重塑,有利于肿瘤进展,但肿瘤细胞如何实现这一效果还未得到合理解释。还有研究报道,高转移性黑色素瘤细胞可以通过外泌体将其侵袭潜能传递给低转移性的黑色素瘤细胞。由此,我们提出科学假设:黑色素瘤细胞分泌的外泌体可能作为重要信息传递介质,将黑色素瘤细胞的侵袭潜能传递给MEF细胞,促进MEF细胞MMP2、MMP9的表达和侵袭能力的变化。本课题围绕该推测,进行了两部分研究:第一部分,提取和鉴定B16F10细胞产生的外泌体;第二部分,通过荧光共聚焦观察MEF对外泌体的摄取情况,并通过Western blot、免疫细胞化学、q RT-PCR和Transwell实验,检测MEF细胞MMP2、MMP9的蛋白和m RNA表达,以及MEF侵袭能力的变化。研究目的:1.使用超速离心法制备小鼠黑色素瘤B16F10细胞分泌的外泌体,并对其结构特征、粒径分布和标志蛋白进行鉴定。2.通过荧光共聚焦观察,确定B16F10外泌体是否可以被MEF细胞摄取;使用B1F10外泌体处理MEF细胞,利用Western blot、免疫细胞化学、q RT-PCR方法,验证外泌体对MEF细胞MMP2、MMP9表达的影响;并通过Transwell试验进一步检测外泌体是否可以造成MEF细胞的侵袭能力改变。研究方法:1.使用超速离心法提取黑色素瘤细胞B16F10培养基中的外泌体,通过电镜负染色观察所获得外泌体的形态结构,使用粒度仪检测黑色素瘤外泌体的粒径分布,并通过Western blot检测该外泌体标志蛋白TSG101和TYRP2的表达。2.从孕鼠胚胎中提取小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),使用PKH26荧光染料标记的黑色素瘤外泌体对MEF细胞进行孵育,利用荧光共聚焦观察MEF细胞对外泌体的摄取过程,并通过流式细胞仪检测MEF细胞对外泌体的摄取率。随后,采用Western blot检测不同浓度(0.31μg/m L、0.62μg/m L、1.25μg/m L、2.50μg/m L、5.00μg/m L)和不同处理时间(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h)的外泌体与MEF细胞共培养后,MEF细胞的MMP2、MMP9表达变化,确定一个最适外泌体浓度。最后,免疫细胞化学验证最适外泌体浓度条件下MEF中MMP2、MMP9的表达变化;q RT-PCR检测最适外泌体浓度条件下MEF中MMP2、MMP9的m RNA表达;Transwell实验检测最适外泌体处理条件下MEF细胞侵袭能力的变化。研究结果:1.电镜结果表明,黑色素瘤细胞分泌的外泌体呈圆形膜性囊泡结构,有立体感且大小均一,外部为清晰可见的双层脂质分子膜,总体呈现茶托状,符合外泌体典型形态特征。粒度仪检测外泌体粒径主要分布在50~200 nm,并且Western blot检测发现该外泌体可以表达标志蛋白TSG101和TYRP2。2.通过观察外泌体的摄取过程,发现黑色素瘤细胞处理12 h后的MEF细胞胞质开始出现红色荧光,24 h以后开始在细胞核周围聚集,48 h时细胞核周围可见明显红色荧光。流式检测发现,B16F10外泌体处理后的MEF细胞摄取阳性率随时间增加而逐渐升高,48 h时达到最高。Western blot结果显示,在相对较低外泌体浓度条件下(0.31μg/m L、0.62μg/m L),MMP2表达量显著增加,随后随外泌体浓度增加表达量逐渐下调。而MMP9表达量则随着外泌体浓度增加而逐渐上调,直到外泌体浓度达到2.5μg/m L,随后表达降低。0.62μg/m L外泌体处理MEF细胞0 h,12 h,24 h,36 h,48 h的结果显示,外泌体处理48 h后,MEF细胞对MMP2和MMP9的表达量出现显著差异。免疫细胞化学在最佳条件下(0.62μg/m L,48h)验证了该结论。q RT-PCR的结果显示,0.62μg/m L外泌体作用于MEF细胞48h后,MMP9的m RNA表达量为对照组的1.44±0.14倍,MMP2的m RNA表达量为对照组的1.32±0.10倍。Transwell检测发现外泌体处理组(104.7±3.8)的MEF细胞侵袭能力与对照组(69.4±1.3)相比显著上升。研究结论:本研究成功提取和鉴定黑色素瘤B16F10细胞产生的外泌体,并且证明B16F10外泌体可以被MEF细胞摄取,导致MMP2、MMP9的表达显著增强,B16F10外泌体处理MEF的最适条件为0.62μg/m L共培养48 h。此外,我们还依据此最适处理条件,从蛋白、m RNA表达以及MEF侵袭能力三个方面对该实验结果进行了充分验证。本研究证明了黑色素瘤外泌体可以促进MEF细胞MMP2、MMP9的表达,从外泌体介导细胞间通讯的角度,验证了黑色素瘤存在通过外泌体向正常细胞传递侵袭性的通讯方式,为寻求控制肿瘤侵袭转移的方法提供一定的研究基础。