论文部分内容阅读
化疗药物在使用过程中普遍存在选择性差而导致的免疫抑制、骨髓抑制、肝肾损伤等毒副作用,同时存在溶解性差、被快速清除等缺点。实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention effect,EPR effect)可以实现尺寸在10-1000 nm的药物递送材料被动靶向至肿瘤部位。肽类树状大分子可以通过共价连接、内部空隙装载等手段递送药物,聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)修饰的肽类树状大分子可以实现纳米尺度的自组装。此外,PEG修饰可以延长血药循环时间、增强EPR效应、赋予其亲水性,降低递送材料毒性等,但不利于递送材料的入胞。基于四肽甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸(Gly-Phe-Leu-Gly,GFLG)的组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB)响应可以实现药物细胞内的靶向释放,基于六肽脯胺酸-缬氨酸-甘氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸(Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly,PVGLIG)的基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinases-2,MMP-2)响应可以实现递送材料的去PEG化。为了解决化疗药物在使用过程中普遍存在毒副作用、溶解性差、被快速清除等缺点,我们设计了一类酶响应的肽类树状大分子药物递送系统:以肽类树状大分子为核心,通过PEG修饰和GFLG共价连接抗肿瘤药物赋予亲疏水性,推动纳米尺度的自组装,通过EPR效应实现肿瘤部位的富集,被肿瘤细胞摄入后,GFLG被CB降解,实现药物的胞内精准释放。此外,我们为了解决PEG不利于入胞,设计了用MMP-2响应的PVGLIG连接PEG和树状大分子,当递送材料通过EPR效应在肿瘤部位富集后,PVGLIG被MMP-2降解,实现去PEG化,使递送材料更好的入胞,从而达到提高治疗效果的作用。方法1.组织蛋白酶B响应肽类树状大分子纳米药物递送系统1)N3-GFLG-GEM合成Boc-Gly-OH和H-Phe-OMe·HCl发生脱水缩合反应,得到Boc-GF-OMe,并在碱性条件下脱羧基保护得到Boc-GF-OH;Boc-Leu-OH和H-Gly-OMe·HCl发生脱水缩合反应,得到Boc-LG-OMe,并在三氟乙酸作用下脱氨基保护,得到H-LG-OMe;Boc-GF-OH和H-LG-OMe发生脱水缩合反应,得到Boc-GFLG-OMe,并脱氨基保护,得到H-GFLG-OMe;H-GFLG-OMe与对叠氮苯甲酸反应,得到N3-GFLG-OMe;脱羧基保护,得到N3-GFLG-OH,与GEM·HCl(吉西他滨盐酸盐)反应得到N3-GFLG-GEM。2)Boc-G3(Lys-Glu)-OMe合成Boc-Lys(Boc)-OH和三(2-氨乙基)胺反应,得到Boc-G1(Lys);脱氨基保护,再与Boc-Lys(Boc)-OH反应,得到Boc-G2(Lys);脱氨基保护,再与Boc-Glu(OMe)-OH反应,得到Boc-G3(Lys-Glu)-OMe。3)PEG-G3(Lys-Glu)-Boc合成Boc-G3(Lys-Glu)-OMe脱羧基保护,再与炔丙胺反应,得到Boc-G3(Lys-Glu)-Alkyne;Boc-G3(Lys-Glu)-Alkyne与N3-PEG通过Cu+催化的点击反应得到PEG-G3(Lys-Glu)-Boc。4)PEG-G3-GFLG-GEM合成PEG-G3(Lys-Glu)-Boc脱氨基保护,再与己炔酸反应,得到PEG-G3(Lys-Glu)-Alkyne;PEG-G3(Lys-Glu)-Alkyne与N3-GFLG-GEM通过Cu+催化的点击反应得到PEG-G3-GFLG-GEM。5)PEG-G3-GFLG-GEM共载DOX称取PEG-G3-GFLG-GEM和去盐酸阿霉素用DMSO溶解;将2 ml去离子水加入编号为Group 1至6的10 ml离心管中,在超声探头超声条件下滴加DMSO溶液,使PEG-G3-GFLG-GEM:DOX质量比分别为2:0、2:0.2、2:0.5、2:1、2:2、2:4,摇床孵育12 h,5000rpm离心5 min,从上清液取1.8 ml冻干,用1.8 ml去离子水复溶。6)共载纳米材料制备及表征按照PEG-G3-GFLG-GEM:DOX(阿霉素)质量比为1:1、方法同前制备共载纳米材料。用粒度电位仪测量粒径和Zeta电位,用透射电子显微镜(TEM)进行形态表征。7)载药量测定配制不同浓度的GEM·HCl和DOX·HCl标准溶液,用紫外-可见分光光度计分别在270nm和480nm测量吸光度。称取PEG-G3-GFLG-GEM和共载纳米材料,配成浓度1mg/ml溶液,分别稀释3倍和5倍测吸光度。8)药物释放将纳米共载材料用p H=5.4缓冲液溶解加入到透析膜中,放入缓冲液,37℃孵育。在不同时间点取样。设置不含木瓜蛋白酶和p H=7.4的对照组。使用高效液相色谱(HPLC)测量取样浓度。9)细胞毒性试验将4T1细胞加入不同浓度的药物和纳米共载材料,用CCK-8试剂盒和酶标仪测定细胞活性。2.基质金属蛋白酶-2和组织蛋白酶B双重酶响应的肽类树状大分子纳米药物递送系统1)PEG-PVGLIG-Alkyne合成Boc-Pro-OH和H-Val-OMe·HCl发生脱水缩合反应,得到Boc-PV-OMe,脱羧基保护,再与H-Gly-OMe·HCl反应得到Boc-PVG-OMe;Boc-Leu-OH和H-Ile-OMe·HCl发生脱水缩合反应得到Boc-LI-OMe,脱羧基保护再与H-Gly-OMe·HCl反应,得到Boc-LIG-OMe。Boc-PVG-OMe和Boc-LIG-OMe分别脱羧基保护和氨基保护后,发生脱水缩合反应得到Boc-PVGLIG-OMe。Boc-PVGLIG-OMe脱羧基保护,与炔丙胺反应,得到Boc-PVGLIG-Alkyne。Boc-PVGLIG-Alkyne脱氨基保护,与m PEG-SC反应,得到PEG-PVGLIG-Alkyne。2)PEG-PVGLIG-G3-OMe合成Boc-G3(Lys-Glu)-OMe脱氨基保护,与叠氮苯甲酸反应,得到N3-G3(Lys-Glu)-OMe,与PEG-PVGLIG-Alkyne通过Cu+催化的点击反应得到PEG-PVGLIG-G3-OMe。3)N3-GFLG-DOX合成将前一部分得到的N3-GFLG-OH与DOX·HCl反应得到N3-GFLG-DOX。4)PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX合成PEG-PVGLIG-G3-OMe脱羧基保护,与炔丙胺反应,得到PEG-PVGLIG-G3-Alkyne,与N3-GFLG-DOX通过Cu+催化的点击反应得到PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX。5)自组装及纳米材料表征配制PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX水溶液,粒度电位仪测量粒径和Zeta电位。6)载药量测定配制不同浓度的DOX·HCl标准溶液,用紫外-可见分光光度计在480nm测量吸光度。配制浓度为1mg/ml的PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX溶液,稀释6倍测吸光度。结果1.组织蛋白酶B响应肽类树状大分子纳米药物递送系统1)通过ESI+、MALDI-TOF-MS和1H NMR等手段对合成产物的分子量和氢谱进行表征,图谱结果显示,PEG-G3-GFLG-GEM被成功合成。2)不含有DOX时,体系成负电荷性质,加入DOX后,Zeta电位变为正值,而且随着DOX的增加,Zeta电位随之升高之后保持稳定。3)PEG-G3-GFLG-GEM自身体系粒径为10nm左右,共载DOX后,粒径分布在100-300之间。4)DOX载药量随着DOX总量的增加而增加。5)按1:1质量比制备的纳米共载材料粒径为290 nm、PDI为0.187,GEM载药量为6.07%,DOX载药量为11.5%。6)释放结果显示GEM在无酶条件下没有释放,在酶存在条件下,p H5.4组释放(20%)大于p H7.4释放(13%)。DOX的释放p H5.4+酶(65%)>p H5.4(50%)>p H7.4+酶(30%)≈p H7.4(30%)7)共载材料组IC50=0.0545 ug/ml,是PEG-G3-GFLG-GEM组(IC50=0.101 ug/ml)的一半,是GEM·HCl组(IC50=0.226 ug/ml)的四分之一。2.基质金属蛋白酶-2和组织蛋白酶B双重酶响应的肽类树状大分子纳米药物递送系统1)通过ESI+、MALDI-TOF-MS和1H NMR等手段对合成产物的分子量和氢谱进行表征,图谱结果显示,PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX被成功合成。2)PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX溶液体系粒径为128nm,Zeta电位为-6.39m V。3)DOX载药量为9.24%。结论1.成功合成GFLG四肽、三代肽类树状大分子G3(Lys-Glu)及具有酶响应性的PEG-G3-GFLG-GEM;PEG-G3-GFLG-GEM可以共载DOX(阿霉素)自组装,形成具有组织蛋白酶B响应性的共载纳米材料。体外实验表明,该共载材料具有良好的抗肿瘤效果。2.成功合成PVGLIG六肽及PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX,且PEG-PVGLIG-G3-GFLG-DOX可以自组装形成纳米材料。