论文部分内容阅读
纤维素作为世界上最为丰富的可再生资源,将纤维素转化为能源一直为人们所关注。但受到纤维素酶活低、成本高等因素的限制,纤维素酶的工业化应用和生产受到制约。寻找到新的纤维素高效降解菌、获得高产量的纤维素酶资源以及提高纤维素酶的效率越来越引起了人们的重视。随着昆虫肠道纤维素降解微生物的研究深入,发现昆虫肠道微生物可作为丰富的纤维素降解菌株、基因、酶资源库。本文以寄生在竹腔体内的竹虫(Omphisa fuscidentalis Hampson)为研究对象,对其肠道微生物进行高通量测序,并对其肠道微生物进行分离、筛选、鉴定,以获得纤维素降解菌株相关资源。主要结论如下: (1)竹虫肠道微生物高通量测序结果显示,竹虫肠道细菌在门水平上主要分布于变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门,在属水平上分布于Commensalibacter属、Dysgonomonas属、不动杆属等10个属。竹虫肠道真菌在门水平上主要以子囊菌门(Ascomycota,98.06%)占绝对优势,在属水平上分布于Phaeoacremonium属、Ophiosphaerella属、支顶孢属和漆斑菌属。通过多样性分析发现竹虫肠道内具有丰富的潜在纤维素降解微生物资源。 (2)完成了竹虫肠道微生物的宏基因组测序,通过与数据库KEGG、eggNOG和CAZy的比对注释,得到竹虫肠道微生物代谢相关基因与碳水化合物酶编码基因数据。经分析发现竹虫肠道微生物具有的344个糖苷水解酶编码基因来自56个不同的家族,与大熊猫、塔马尔沙袋鼠、食木高等白蚁肠道微生物和牛瘤胃微生物宏基因组测序样品比较发现,竹虫肠道微生物有13个特异GH家族基因,并具有丰富的半纤维素酶和低聚糖降解酶编码基因。 (3)从竹虫肠道内以CMC为唯一碳源作为筛选压力,筛选得到54株纤维素降解菌株,并对纤维素降解菌株降解能力较强菌株10株,编号为C-41,C-25,C-24,C-17,C-13,C-5,W-26,W-17,W-9,W-3,通过DNS显色法测定其CMC酶活、微晶纤维素酶活、纤维二糖酶活以了解菌株纤维素降解能力。通过对分离菌株构建系统发育树发现,其主要来自于变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门,这与高通量测序结果保持一致。 (4)从竹虫肠道筛选获得1株新菌BRTC-1,通过16S rRNA基因、rpoB基因和gyrB等基因序列比对,GenBank登录号分别为KU560468.2、KU837228、KU981067。结合一系列多相分类学鉴定,鉴定菌株BRTC-1为Acinetobacter属新种,命名为Acinetobacter larvae,模式菌株为BRTC-1T,分别保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心(保藏号ACCC19936T)和日本微生物保藏中心(保藏号JCM31367T)。 (5)通过PacBio三代测序技术完成了菌株Acinetobacter larvae BRTC-1T的全基因测序(NCBI登录号:CP016895.1),质粒pRW1和pRW2登录号分别为CP018141.1和CP018142.1。Acinetobacter larvae BRTC-1T的全基因组大小为3,741,098 bp, GC含量为41.64%。蛋白编码基因数目为3,325个,55个假想未鉴定基因,非编码RNA基因总共102个。质粒pRW1和pRW2序列大小分别为12170 bp和8,455 bp,GC含量分别为33.86%和34.54%。通过数据库注释结果表明,其基因组中含有54个纤维素降解相关的碳水化合物基因,包括14个GHs基因,23个GTs基因,5个CEs基因,2个AAs基因和10个CBMs基因,全基因组信息的分析为进一步揭示其纤维素降解机制和其它具有应用价值的功能基因挖掘提供了坚实基础。 (6)通过酶谱分析鉴定了竹虫肠道内存在外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和木聚糖酶,滤纸降解实验验证了竹虫肠道微生物具有独立降解纤维素的能力,高通量测序结果显示滤纸降解体系中的大量纤维素降解微生物,通过本次研究可以加深对竹虫肠道微生物在纤维素降解方面的认识,以及为之后相关微生物资源的挖掘奠定基础。